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新开发的重组无细胞蛋白质合成系统
PUREfrex® 2.0
◆背景
PUREfre试剂盒是基于东京大学Takuya Ueda教授发明的PURE系统技术而新开发的一种重组无细胞蛋白质合成试剂。
反应系统由蛋白质、核糖体、氨基酸和NTPs组成(参考文献1,2),其中,蛋白质具有转录、翻译和能量再生的功能。蛋白质与核糖体分别单独高度纯化后组装成蛋白质合成系统,当合成蛋白质时,只需添加编码所需蛋白质的模板DNA或mRNA到反应混合液中并放置几个小时。重组系统只与组装、翻译相关因素有关,并根据需要来调整反应混合物的成分,而不必考虑高背景对下游应用的影响。
改进PUREfrex试剂盒组分纯化过程后,大大降低了RNA酶与β-半乳糖苷酶的污染。此外,每1 L PUREfrex反应混合物消耗低于0.1EU的脂多糖(LPS)。PUREfrex试剂盒的所有蛋白组分没有用于纯化与检测的标记,允许使用任何标记与蛋白质结合纯化产物。
◆应用
用于制备以下蛋白质
● 原核蛋白
● 真核蛋白
● 膜蛋白
● 二硫键蛋白质
● 含有非天然氨基酸的蛋白质等
蛋白质科学基础研究
● 翻译
● 蛋白质合成后折叠
用于体外显示
● 核糖体展示技术
● mRNA展示技术
◆特点与优点
PUREfrexTM试剂盒采用仅由翻译系统组成的PURE系统创新技术,此改进提高了试剂盒组分纯度。表1表示PUREfrexTM试剂盒与创新PURE系统纯化方法的比较。每1 L PUREfrexTM反应混合物消耗低于0.1EU脂多糖,并降低了核糖核酸酶与β-半乳糖苷酶的污染(图1)。
此外,已经审查每个部件处于完好活性,PUREfrexTM试剂盒各部件没有用于纯化与检测的标记,允许任何标记与蛋白质结合。图2是用组氨酸标记的合成蛋白质纯化结果。
PUREfrexTM | 原始 | |
蛋白质 | ||
标记 | 无 | 组氨酸标记 |
列数 | 3 | 1 |
清洗剂清洗 | + | - |
核糖体 | ||
清洗剂清洗 | + | - |
转运RNA | ||
清洗剂清洗 | + | - |
Original*;The reaction mixture prepared according to Shimizu et al.(2005) Methods,vol.36,p.299
表1 PUREfrexTM与创新PURE系统的组分纯化方法比较。
图1PUREfrexTM与原始PURE系统中反应混合物受污染情况的比较
测量并比较LPS含量及RNA酶与β-半乳糖苷酶活性,以此比较PUREfrexTM与创新PURE系统中反应混合物受污染的量。
将创新PURE系统(参考文献2)的量与活性设置为100。与创新PURE系统中污染物含量相比,PUREfrexTM系统中污染物含量较低。
使用PUREfrexTM合成具有组氨酸标记的GFP(His标记),并用金属螯合树脂纯化。
图2显示仅需一步即可完成高纯度纯化合成的His标记蛋白质。
◆活细胞研究的其他优点
● 无需遗传转化
● 无需考虑培养条件
● 无需考虑表达所需的诱导条件
● 无需考虑纯化条件
◆PUREfrex 2.0 与DS 补充剂
● 升级为PUREfrex 2.0系列!
● 大大提高合成数量!
● 合成数量大大提高!(-10倍次数)
● 在保证PUREfrex特性的基础上改进了反应试剂成分(减少RNA酶、β-半乳糖苷酶和脂多糖(LPS)的污染),并提高合成效率。
● 用于250ul或5 * 250ul反应(版本1用于500ul反应)
◆试剂盒组成
用于250ul反应
试剂 | 容量 | 说明 | 保存 |
试剂I (白色) | 125 L | 氨基酸,核苷酸,转运RNA和酶底物等。 | -20°C |
试剂I (白色) | 12.5 L | 溶解在30%甘油缓冲液中的蛋白质 | -20°C or -80°C*1 |
试剂III (红色) | 12.5 Lx2 | 核糖体(20μM) | -80°C*1 |
DHFRDNA(clear)*2 Sequence (text) |
10 L | 含有编码大肠杆菌DHFR基因的PCR产物(20ng / L)。 | -20°C |
(1) 剩余的溶液应快速在液氮、干冰或乙醇中冻结,并储存于-80℃。如有必要,分装剩余溶液,并尽可能避免反复冻融。
(2) 在合成DHFR的 50μL反应液中加入2.5μLDHFR DNA。
产品编号 | 产品名称 | 产品规格 |
GFK-PF201-0.25-EX | PUREfrex2.0 | 1KIT |
GFK-PF201-0.25-5-EX | PUREfrex2.0 | 1KIT |
GFK-PF003-0.5-EX | DnaK Mix | 1KIT |
GFK-PF004-0.5-EX | GroE Mix | 1KIT |
GFK-PF005-0.5-EX | DS supplement | 1KIT |
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