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文献和实验用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验,因为与甲醇相比,乙腈的溶剂强度较高且粘度较小,并可满足在紫外185~205nm处检测的要求,因此,综合来看,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。 在分离含极性差别较大的多组分样品时,为了使各组分均有合适的k值并分离良好,也需采用梯度洗脱技术。 反相色谱中,如果要在相同的时间内分离同一组样品,甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系: C乙腈=0.32C2甲醇+0.57C
用15000r/min离心30min. 5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。 多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,医学教|育网|收集整理PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合
结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀,常用牛血清白蛋白,卵白蛋白,聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryb S—400 (丙烯葡聚糖S—400 )层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。一、待标记蛋白质的准备(1)透析除盐:蛋白质溶液内应除去多余的电解质,不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位,影响蛋白质的吸附,因此,标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水(0.005mol/L NaCl , pH7.0)透析。(2)去除蛋白质中的
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