Pfu Kit
规格价格:1 ml×5(200次,50 μl体系/次)520.00元
产品简介
Pfu Kit是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液,含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时,仅需将反应缓冲液与Pfu DNA聚合酶按照比例混合后,在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR,大大简化操作过程,缩短操作时间,降低污染(加样次数减少)。同时,由于体系内含有优化剂与增强剂,能够显著增强PCR扩增的灵敏度。
Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70-75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。扩增产物具有平末端。
产品组成
Component |
KL3022P |
2× Pfu Reaction Mix |
1 ml×5 |
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) |
160 μl |
本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品,PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如没特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存2年。
质量控制
纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final concentration (50 μl reaction volume) |
1 |
2× Pfu Reaction Mix |
25 μl |
1× |
2 |
upstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
3 |
downstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
4 |
Pfu DNA聚合酶(5U/μl)[2] |
0.5-1 μl |
2.5U-5U |
5 |
template DNA[3] |
1-4 μl |
<1μg |
6 |
超纯水[4] |
To 50 μl |
- |
optional |
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5] |
Variable |
- |
[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。
[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。
Template |
Dosage |
人类基因组DNA |
0.1μg-1μg |
λDNA |
0.5ng-5ng |
大肠杆菌基因组DNA |
10ng-100ng |
质粒DNA |
0.1ng-10ng |
[4] 可单独订购超纯水(Cat. #:P9021/P9022/P9023)。
[5] 可单独订购25mM MgCl2(Cat. #:P9031)和PCR Enhancer(Cat. #:P9041)。
2. 设定反应程序进行PCR反应
Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
Denaturation |
94℃ |
30 sec |
25-35 |
Annealing |
55-68℃[1] |
30 sec |
Extension |
72℃ |
Variable[2] |
Final Extension |
72℃ |
5-10 min |
1 |
[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。
[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。
3. 分析结果
反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。
无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1:;10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer(Cat. #:P9041)、MgCl2(Cat. #:P9031)等可提高产量。
操作注意事项
1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。
2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)
PCR(纯化)产物 |
1-7 μl |
10× Taq Buffer(Mg2+Plus) |
1 μl |
dATP |
0.2 mM |
Taq DNA聚合酶 |
5U |
超纯水 |
To 10 μl |
3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。
4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。
引物设计注意事项
引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。