兔源一抗免疫组化检测试剂盒(FITC荧光+DAB显色)

本试剂盒适合于一抗为兔IgG来源的免疫组化实验，DAB及FITC显色。SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质，同亲和素一样，对生物素有极高的亲和力，亲和素是一个碱性蛋白质（PI=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC即StreptAvidin-Biotin Complex，SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶或者FITC和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶与FITC将保证SABC具有很高的敏感性。

试剂盒组成：

组分	规格
封闭液（5% BSA）	10ml
Bio-羊抗兔IgG浓缩液	100μl
SABC-FITC浓缩液	100μl
SABC-POD浓缩液	100μl
稀释液	30ml
20×DAB显色液A	1ml
20×DAB显色液B	1ml
抗荧光衰减封片剂	10ml

保存：-20℃，如经常使用，可将封闭液，稀释液，20×DAB显色液B和抗荧光衰减封片剂存放于2～8℃以方便使用。

操作步骤（以石蜡切片热修复为例）：
1．切片常规脱蜡至水。3% H2O2室温5～10分钟以灭活内源性酶（如果FITC，可省掉此步）。蒸馏水洗3次。
2．热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10分钟后，反复1～2次。冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1～2次。
3．滴加5% BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，免洗。
4．用稀释液将一抗按一定比例稀释（稀释后的一抗 4℃可保存一周），也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗，37℃ 1小时孵育左右或20℃ 2小时左右，也可4℃过夜。PBS（pH7.2～7.4）洗涤3次，每次2分钟（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间）。
5．根据使用量，用稀释液将bio-羊抗兔IgG浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10μl bio-羊抗兔IgG浓缩液，混匀即成工作液，此工作液4℃可保存一周)。滴加生物素化羊抗兔IgG工作液，20～37℃处理30分钟。PBS（pH7.2～7.4）洗涤3次，每次2分钟。
  如果用荧光观察，请接步骤6、7，如果用DAB显色，请直接转至步骤8。
6．根据使用量，用稀释液将SABC-FITC浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10μl SABC-FITC浓缩液，混匀即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周)滴加SABC-FITC工作液，20～37℃，30分钟(避光)。PBS（pH7.2～7.4）洗涤4次，每次5分钟。
7．滴加抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜观察。
8．根据使用量，用稀释液将SABC-POD浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10μl SABC-POD浓缩液，混匀即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周)，滴加SABC-POD工作液，20～37℃，30分钟。PBS（pH7.2～7.4）洗涤4次，每次5分钟。
9．DAB显色:根据用量，用PBS（pH7.2～7.4）配制，按1ml PBS加入50μl 20×DAB显色液A，加入50μl 20×DAB显色液B，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。
10．苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。

对于细胞爬片：常规固定后，PBS漂洗两次，再用0.5% Txiton X-100室温20分钟，PBS漂洗两次，3% H2O2（如果用FITC，刚可省掉此步）处理15分钟；PBS漂洗两次，下接上面第4步。
对于冰冻切片：固定后，可用PBS漂洗两次，再接上面第二步。

注意事项：
1．如果用DAB染色背景过高，在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.01～0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2～7.4）洗涤切片4次，PBS洗2次，然后DAB显色。
2．如果用FITC观察背景过高，在SABC反应之后，用加有0.01～0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2～7.4）洗涤切片4次，PBS洗涤2次，然后封片观察。
3．因为免疫组化指标众多，标本不一，此步骤仅作参考。