哈维氏弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）

哈维氏弧菌核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）
◆ 产品说明
动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸
片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于哈维氏弧菌的检测，检出限为 103copies/μl 基因组 DNA。
◆ 产品组成（48 测试）
试剂 含量
A-VH-I 22μL× 48 管
B-I 90μL × 1 支
PG-VH-I 50μL × 1 支
◆ 适用仪器
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C 等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96 等
荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭
菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
 1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
 3）第三区：扩增及产物分析区。
★分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30
秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照下述方法处理样品。
一. 直接检测
1. 病灶组织
(1)若对样本不增菌直接进行检测，则取患病动物的病灶组织做匀浆备用。
2. 水体
1）取 10～100mL 养殖水，用筛网过滤，取滤液通过 0.22um 的硝酸纤维膜过滤；
2）将滤膜剪碎振荡重悬于 500 μL 0.9% NaCl 水溶液或无菌生理盐水，12000 rpm 离心 5 min，尽量弃净上清液。
二. 增菌检测
取待检样品 25g（mL），加入 225mL 的 TYE 液体培养基，用旋转刀片式均质器以 8000r/min 均质 1 min，或者
请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月
拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵或均质袋中磨碎，再加
入 10mL TYE 液体培养基，于摇床培养 24h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
参照水生动物病害基因组 DNA 快速提取试剂盒说明书的提取步骤。
2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
取出所需测试数的已含有反应液 A-VH-I 的 PCR 管，将试剂完全解冻，离心 30 秒，在管盖上标记管名（阴性
对照管 NG、样品 XX、阳性对照管 PG）。打开管盖向各管管底分别加入 1μL B-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管
分别沿管壁加入 2μL 模板，顺序为待测样品模板、PG-VH-I，依次盖好各管管盖，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器 63℃条件下反应 45 min。待仪器升温至 63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤 2 中
离心后的 PCR 反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。
②若使用荧光定量 PCR 仪，则荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 None，将 63℃ 15 s，63℃ 45 s 作为一个
循环，于 63℃ 45 s 处收集荧光信号，45 个循环。
若使用其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①恒温仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有哈维氏弧菌；若显示“阴性”，且没有出现 S 型扩增曲
线，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。
②在荧光定量 PCR 仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有哈维氏弧
菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。
★ NG 反应管结果显示“阴性”，PG 反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果
仍为无效，请与技术支持人员联系。