人的胰岛素样因子1 ELISA试剂盒

人胰岛素样生长因子1定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的IGF-1浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

 

IGF-1简介：

胰岛素样生长因子1（IGF-1）是一种促进有丝分裂的多肽，体外能够促进包括肌细胞、骨细胞和软骨细胞和组织分化和维持生长。

IGF-1是一个具三个内部二硫键的70个氨基酸残基的多肽，属于胰岛素家族，该家族包括胰岛素和耻骨松驰素等。IGF-1在结构和功能上与胰岛素都很近似，但比胰岛素在生长刺激方面活性更强。

IGF-1在胎儿的发育、生长到成年阶段的调控有重要作用。它调控蛋白的合成，糖的利用。IGF-1在细胞的周期和调亡中也起重要作用。IGF-1的信号主要通过与I型受体结合后酪氨酸激酶的通路来实现调控的。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IGF-1的浓度。IGF-1 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IGF-1 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IGF-1 抗体后，抗人IGF-1 抗体与IGF-1 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IGF-1 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IGF-1 浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IGF-1 浓度。

 

人IGF-1定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分	规格（96T/48T）
人IGF-1预包被板	12条/6条
5X标准品稀释液	20ml/10ml
人IGF-1标准品	2/1支(冻干)
人IGF-1生物素化抗体	10ml/5ml
亲和素连接的HRP酶	10ml/5ml
浓缩洗涤液 20×	30ml/15ml
TMB底物	10ml/5 ml
中止液	5ml/3 ml
封板胶纸	3/2张
说明书	1份

 

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用标准品稀释液稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

 

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3. 将5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品:按标签复溶体积加入1×标准品稀释液复溶使IGF-1终浓度达到2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                    

 4.去离子水或双蒸水；

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟。如果是血清血浆样本，不同样本稀释比例不一样，一般范围在30~300倍，如无明确范围，建议从40倍稀释，如果样本浓度过高，超过检测范围，请加大稀释倍数后重新稀释检测。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml	典型OD值1	典型OD值2	OD平均值
0	0.2762	0.315	0.2956
62.5	0.3965	0.4249	0.4107
125	0.6524	0.474	0.5632
250	0.7956	0.8326	0.8141
500	1.1025	1.0801	1.0913
1000	1.4581	1.6627	1.5604
2000	2.1481	1.9505	2.0493

人IGF-1参考标准曲线

 

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为32.5pg/ml。

2.特异性：与人FGF acidic,FGF basic,HGF,IGF-II,Insulin,PDGF-AA,PDGF-AB,PDGF-BB,TGF-β1,TGF-β2 ,VEGF

等没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

 

参考文献:

1. Blundell, T.L. and R.E. Humbel (1980) Nature 287:781.

2. Grimberg, A. and P. Cohen (2000) J. Cell. Physiol. 183:1.

3. Hall, K. and V.R. Sara (1983) Vitamin. Horm. 40:175.