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96T/48T
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的GM-CSF浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。
GM-CSF简介:
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)最早作为粒细胞-巨噬细胞前体细胞体外增殖的刺激因子来命名的。它可由包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞等细胞对炎症刺激而产生。人的GM-CSF是由包括17个信号肽的前体裂解为包括124和127氨基酸的成熟蛋白。
GM-CSF是红细胞系、巨核细胞和嗜酸粒细胞等的祖细胞的生长因子。对成熟的造血系细胞来说,GM-CSF是一种生长支持因子,是粒细胞、单核/巨噬细胞、嗜酸性细胞的功能活化因子。GM-CSF也被发现对非造血系细胞具有重要的作用,如它能介导人的内皮细胞的的迁移和增生等。
在人的前列腺癌、严重性创伤、甲状腺癌、严重的粘膜炎、真菌感染、AIDS、急性淋巴性白血病、恶性血液病、感染、肺癌等患者的血液中都检测出有相关的GM-CSF的波动。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中GM-CSF的浓度。GM-CSF捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的GM-CSF会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人GM-CSF抗体后,抗人GM-CSF抗体与GM-CSF接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在GM-CSF将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,GM-CSF浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中GM-CSF浓度。
人GM-CSF定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 |
规格(96T/48T) |
人GM-CSF预包被板 |
12条/6条 |
样本分析缓冲液 |
5ml/3ml |
标准品稀释液 |
10ml/5ml |
人GM-CSF标准品 |
2支/1支(冻干)* |
人GM-CSF生物素化抗体 |
10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 |
10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× |
30ml/15ml |
TMB底物 |
10ml/5ml |
中止液 |
5ml/3ml |
封板胶纸 |
3/2张 |
说明书 |
1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作;
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;
B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;
C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测,
D.标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;
3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。
注:人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2~8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应,请严格控制在25~28℃。
9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.如有5X标准品稀释液按所需用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。
4.标准品:按标签复溶体积加入准品稀释液复溶使GM-CSF终浓度达到1000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
实验过程需自备的材料:
1.不同规格的加样枪及相应的枪头;
2.酶标仪;
3.自动洗板机;
4.去离子水或双蒸水;
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。
2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本, 如稀释量大,请将样本与样本分析缓冲液等量加入,不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟。
6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml |
典型OD值1 |
典型OD值2 |
OD平均值 |
0 |
0.1258 |
0.0894 |
0.1076 |
31.25 |
0.3589 |
0.1949 |
0.2769 |
62.5 |
0.1598 |
0.7944 |
0.4771 |
125 |
0.8954 |
0.6958 |
0.7956 |
250 |
1.0247 |
1.3673 |
1.196 |
500 |
1.6853 |
1.7229 |
1.7041 |
1000 |
2.2471 |
2.2267 |
2.2369 |
人GM-CSF参考标准曲线
注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。
灵敏度,特异性和重复性:
1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为12.5pg/ml。
2.特异性:与人EGF,Epo,FGF acidic,FGF basic,G-CSF,HGF,IFN-γIGF-I , IGF-II, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10,IL-12,IL-13,KGF,LIF,M-CSF,MCP-1,SCF,TGF-α,TGF-β1,VEGF等没有交叉反应。
3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Gasson, J. (1991) Blood 77:1131.
2. Costello, R.T. (1993) Acta Oncol. 32:403.
3. Crosier, K.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7744.
4. Lopez, A.F. et al. (1990) J. Cell Physiol. 145:69.
5. Omori, F. et al. (1992) Biotherapy 4:147.
6. Nakamura, Y. et al. (1993) Am. Rev. Respir. Dis. 147:87.
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