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96T/48T
人自然杀伤细胞刺激因子定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-12P70浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。
IL-12P70简介:
IL-12P70也称为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(CLMF)主要是由受激发的巨噬细胞产生的多效性细胞因子。IL-12P70还可由树突状细胞、单核细胞、郎格罕细胞、嗜中性粒细胞和角化细胞等产生。
具生物学活性的人IL-12P70是二硫键连接一个40 kDa (p40)和35 kDa (p35)的亚基的异型复合体,即70 kDa (p70)。成熟的人40 kDa (p40)亚基有13个半胱氨酸和5个可糖基化的N末端的N313个氨基酸的蛋白。无论是p40 还是 p35亚基都不具有IL-12的生物学活性,但由两个p40亚基构成的同型复合物可与IL-12P70受体结合,从而充当IL-12P70的拮抗剂。虽然小鼠的IL-12P70对人和小鼠细胞都有活性,但人的IL-12P70只对人细胞有生物活性。
IL-12P70对T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞有多种作用,这些作用包括在T细胞和NK细胞中诱导干扰素和肿瘤坏死因子的生产,提高T细胞和NK细胞毒素的活性的以及刺激T细胞和NK细胞的分化。IL-12P70是IFN-γ的强烈诱导物,但诱导出的IFN-γ反过刺激吞噬细胞产生IL-12P70和其它促炎性因子,这样,由IL-12P70诱导的IFN-γ就在感染时促炎症反应中反馈放大的机理中扮演重要的角色。IL-12P70 在通过提高Th1细胞介导的免疫反应中有重要作用。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-12P70的浓度。IL-12P70捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的IL-12P70 会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-12P70 抗体后,抗人IL-12P70 抗体与IL-12P70 接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在IL-12P70 将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,IL-12P70 浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中IL-12P70 浓度。
人IL-12P70定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 |
规格(96T/48T) |
人IL-12P70预包被板 |
12条/6条 |
样本分析缓冲液 |
5ml/3ml |
标准品稀释液 |
10ml/5ml |
人IL-12P70标准品 |
2/1支(冻干) |
人IL-12P70生物素化抗体 |
10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 |
10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× |
30ml/15ml |
TMB底物 |
10ml/5ml |
中止液 |
5ml/3ml |
封板胶纸 |
3/2张 |
说明书 |
1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作;
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;
B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;
C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;
D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;
3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。
注:人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2~8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应,请严格控制在25~28℃。
9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.如有5x标准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释备用。
4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-12P70终浓度达到1000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300μl,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
实验过程需自备的材料:
1.不同规格的加样枪及相应的枪头;
2.酶标仪;
3.自动洗板机;
4.去离子水或双蒸水;
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。
2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大,请将样本与样本分析缓冲液等量加入,不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟。
6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml |
典型OD值1 |
典型OD值2 |
OD平均值 |
0 |
0.0866 |
0.0682 |
0.0774 |
31.25 |
0.2046 |
0.1562 |
0.1804 |
62.5 |
0.3617 |
0.3203 |
0.341 |
125 |
0.6452 |
0.5734 |
0.6093 |
250 |
1.0872 |
0.9636 |
1.0254 |
500 |
1.59 |
1.5018 |
1.5459 |
1000 |
2.1676 |
2.0466 |
2.1071 |
人IL-12P70参考标准曲线
注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。
灵敏度,特异性和重复性:
1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为5.8pg/ml。
2.特异性:与人的G-CSF、IL-6、IL-12/IL-23 p40及小鼠IL-12 p70、IL-12/IL-23 p40无交叉反应性。
3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Verma, N.D. et al. (2004) SwissProt Accession #:Q9R103.
2. Hamza, T. et al. (2010) Int. J. Mol. Sci. 11:789.
3. Shortman, K. and W. Heath (2010) Immunol. Rev. 234:18.
4. Gearing, D.P. and D. Cosman (1991) Cell 66:9.
5. Khalife, J. et al. (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:69.
6. Kang, K. et al. (1996) J. Immunol. 156:1402.
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