猪瘟（csfv）病毒免疫荧光检测试剂盒

猪瘟（csfv）病毒免疫荧光检测试剂盒使用说明书
【产品简介】
猪瘟病毒免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，单克隆抗体先与病毒反应，然后间接的与荧光抗鼠二抗反应，用这种荧光抗体检测细胞内的猪瘟病毒含量。
【产品内容】

试剂盒成分	数量	备注
csfv一抗工作液	11ml*1	4℃存放
浓缩荧光二抗	100ul*2	-20℃存放
固定液	11ml*1	4℃存放
样品稀释液	45ml*3	4℃存放
盖板膜	2张	-
说明书	1份	-

【备用的器材】
长满单层的  ST细胞1瓶
排枪
排枪配套使用的枪头
加样槽
离心管
96孔细胞培养板两块       ST细胞
【试剂配置】
6%MEM培养基：MEM培养基+6%猪瘟专用血清
2%MEM培养基：MEM培养基+2%猪瘟专用血清
荧光二抗工作液：将浓缩荧光二抗按照1:50稀释（用样品稀释液稀释50倍，现用现配）
【操作步骤】
用6%MEM培养基将st细胞铺96孔板一个（细胞密度为3*10⁵/ml），次日弃上清接毒。
接毒步骤如下：

1. 无血清培养基将病毒液作连续10倍的稀释，从10⁰-10^-8。
2. 将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100微升。
3. 放置于37℃吸附1小时后，补入2%MEM培养基每孔100ul，置于37℃CO₂培养箱培养。
4. 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5. 逐日观察，一般需要观察120小时即可测定荧光。

荧光测定步骤如下：
1.弃掉96孔细胞培养板上清，每孔加入150微升样品稀释液，静置30秒，甩去孔内液体，重复洗3次，吸干水分，不用拍板。
2. 每孔加入50微升-20℃的固定液放入-20℃静置20分钟，弃掉上清，不用拍板。
3.同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
4. 每孔加入一抗工作液50ul，盖上盖板膜，放置于37℃40分钟后，同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
5. 每孔加入荧光二抗工作液50ul，盖上盖板膜，放置于37℃40分钟后，同上（第一步）重复洗涤3次，吸干水分，不用拍板。
6. 观察荧光显微镜并根据下表记录不同稀释度的荧光孔数，之后根据10^-1～10^-8计算出病毒的TCID₅₀含量。
 例:

csfv病毒液稀释度	出现荧光的孔数	出现荧光孔的比率
100	8	8/8=1
10-1	8	8/8=1
10-2	8	8/8=1
10-3	7	7/8=0.875
10-4	3	3/8=0.375
10-5	1	1/8=0.125
10-6	0	0/8=0
10-7	0	0/8=0
10-8	0	0/8=0

LgTCID₅₀=l-d(s-0.5)      
L:最高稀释度的对数
D:稀释度对数之间的差
S:阳性孔比率总和
LgTCID₅₀=l-d(s-0.5) =-1-1*（3.375-0.5）=-3.875
  TCID₅₀=10^-3.875/ml
即：将该病毒稀释10^-3.875接种100ul可使50%的细胞发生病变。   
【注意事项】
（1）切记做不接毒的空白细胞对照。
（2）样稀清洗与加样时要温柔，并从同一个位点加入。
（3）加样槽用前请用一次性塑料手套套住，加不同溶液时更换手套，防止不同溶液的交叉污染。
（4）配制好的荧光二抗避光保存，现配现用，固定液放-20℃ 1h后再使用。
（5）操作过程中的移液、计时和洗涤必须精确，以免影响结果。
（6）被测病毒-20化开后需要及时接毒，不可放置室温；配置好的培养放4℃于30天内使用。
（7）如果不需要TCID₅₀数值，请根据10⁰～10^-8直接观察荧光显微镜即可。
【贮藏与有效期】
低温避光保存，有效期为12个月。
【产品规格】2*96T
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