EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101 Chemically Competent Cell

产品货号： JK-G8032                    

保存条件： -80℃   

产品规格 :
 

EHA101​	10×100μl
	50×100μl
	100×100μl

基因型

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline

简要说明

JKBioEHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：strep、kan，赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104 cfu/μg DNA。

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

4. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。

操作说明

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 每100 μl JKBio 感受态加1 μg（体积不大于10 μl）质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

备注

1、农杆菌相关抗生素配方：
 

抗生素	配方	原液浓度	工作浓度
羧苄青霉素 (carb)	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	50 mg/m	50 μg/ml
硫酸卡那霉素 (kan)	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
链霉素 (strep)	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平 (rif)	DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
庆大霉素 (gent)	双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

2、常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
 

农杆菌菌株	羧苄青霉素(carb)	链霉素(strep)	利福平(rif)	庆大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	R	R	S	S
EHA101	S	R	R	S	R
EHA105	S	R	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101 S	S	R	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液体)/L	LB(固体)/L	component	YEB(液体)/L	YEB(固体)/L
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	调PH到7.0	调PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	调PH到7.0	调PH到7.0
			Agar	－	15 g