Annexin V-EGFP/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

产品简介：
    细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。
    用标记了EGFP的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（EGFP-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（EGFP+ /PI+ ）；而右下象限为凋亡细胞，显现（EGFP+ /PI-）。

使用方法：

样品染色：

1. 离心收集悬浮细胞，离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。（贴壁细胞用胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性）。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。（2000RPM，离心时间5min收集细胞）。
3. 用400ul 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1 X 10⁶ cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-EGFP染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入10ul PI染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。
6. 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

  经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为488nm。
  按照常规的流式凋亡检测的操作即可。 Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FL1通道检测；PI红色荧光通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。
荧光显微镜观察：

   1.滴加用Annexin V-EGFP/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
    注：对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400μl Annexin V结合液于孔中。再加入5μl Annexin V-EGFP染色液与10μl Propidium Iodide染色液，混匀。避光室温反应10分钟。
   2.在荧光显微镜下用双色滤光片观察。使用荧光显微镜上的FITC 滤镜（蓝光），Annexin V-EGFP荧光信号呈绿色；使用Rhodamine 滤镜（绿光），PI荧光信号呈红色，Propidium Iodide 染色阳性的细胞则会在整个胞质内呈现不同强度的黄-红色，早期凋亡细胞不会被Propidium Iodide 染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示出黄-红色的胞质，红色的胞核和环绕细胞的绿色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。