EndoFree Plasmid Giga Kit (5)

纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA

• 纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/µg
• 纯化流程快，同时去除内毒素
• 获得高产量、高拷贝质粒DNA
• 使用LyseBlue，获得最佳的裂解和高产量的DNA

EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges过滤快速澄清裂解液，DNA的最高产量500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，适合超转染级纯的应用。

质粒纯化方法与转染效率。

使用两种方法独立制备pRSVcat，分别使用脂质体介导的方法转染到COS-7、HeLa和LMH细胞中，及使用磷酸钙转染至Huh7细胞中。平均转染效率以相对于QIAGEN Plasmid Kit（100％）制备的DNA的转染效率表示。

QIAGEN Plasmid Kit procedures.

Neutralized bacterial lysates are incubated directly in the QIAfilter Cartridge and cleared in seconds by filtration. After the endotoxin removal step, the cleared lysate is then loaded onto the anion-exchange tip where plasmid DNA selectively binds under appropriate low-salt and pH conditions. RNA, proteins, metabolites, and other low-molecular-weight impurities are removed by a medium-salt wash, and ultrapure plasmid DNA is eluted in high-salt buffer. The DNA is concentrated and desalted by isopropanol precipitation and collected by centrifugation.

质粒纯度与转染效率。

图中显示了在无血清条件下，在悬浮液中生长的CHO SSF3 X9细胞中，质粒DNA的数量和质量对转染效率的影响。每个点代表三次独立实验的平均值；Rel. LU：相对光单位。（数据由瑞士巴塞尔诺华公司的M. Zang-Gandor,提供。）

细菌细胞壁。

大肠杆菌细胞壁示意图。

 

 

性能

EndoFree Plasmid Giga Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液，并使用重力流QIAGEN-tip 10000阴离子交换柱纯化质粒DNA。2.5升培养菌液最多可纯化10 mg DNA。纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/µg DNA）。

选用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit纯化低拷贝质粒和科斯质粒，将会得到更好的效果，因为后者需要较大的培养体积，而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。

 

质粒制备中的内毒素水平*

* 宿主菌：大肠杆菌DH5α  质粒：pRSVcat。
^† 1  ng LPS = 1.8 EU。 
^‡ 根据表中数据计算 ""。

质粒制备方法	内毒素（EU†/µg DNA）	平均转染效率‡
EndoFree Plasmid Kit	0.1	154%
QIAGEN Plasmid Kit	9.3	100%
2x CsCl	2.6	99%
Silica-gel slurry	1230.0	24%

 

无内毒素DNA转染原代细胞的高转染率*

* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率，由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。（数据由C. Chew and J. Parente提供，Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.）

DNA纯化方法	转染细胞比例
EndoFree Plasmid Kit	21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit	8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry	5.2% ± 0.74

原理

纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空方式轻松高效的清除大量细菌裂解液（注意：该试剂盒不包含瓶子）。

QIAGEN-tips中独特的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它卓越的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如苯酚，氯仿，溴化乙锭和CsCl，最大限度地减少对用户和环境的危害。

内毒素，又称脂多糖或LPS，是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放出来，并显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率。此外，内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂，影响转染实验中质粒DNA的摄取。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL-1和前列腺素等的合成。总体而言，内毒素在转染实验中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。

操作流程

在碱性条件下，细菌细胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱。最后DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。

应用

使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：转染，包括原代、敏感以及悬浮细胞

基因治疗研究 

基因沉默 

显微注射

特点	参数
Applications	Transfection, gene therapy
Culture volume/starting material	2.5 liters culture volume
Plasmid type	High-copy, low-copy, cosmid DNA
Processing	Manual (vacuum)
Samples per run; throughput	1 sample per run
Technology	Anion-exchange technology
Time per run or prep per run	310 min
Yield