副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒价格

特别提示：包括副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒
英文名称：Haemophilus parasuis Fluorescent qPCR Kit
产品货号：BTN11-160
产品规格：50次

本产品是基于PCR的HPS检测试剂盒。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属巴斯德氏菌科嗜血杆菌属，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)且没有运动性的小型、多形性、革兰氏阴性杆菌。HPS 可引起猪多发性浆膜炎、关节炎，严重时导致体温升高、呼吸困难甚至死亡, 给养猪业带来巨大的经济损失。目前对HPS的诊断主要是细菌分离培养和PCR。HPS 培养需要NAD、马血清和5% CO2 环境，需24-36小时，还容易出现杂菌污染，因此PCR是目前诊断HPS zuì常用的方法。

产品特点：
1. 灵敏度高，分析灵敏度可以达到50拷贝/uL，远高于细菌培养法。
2. 特异性高，根据HPS的16S rDNA基因保守区设计引物，可扩增出强、中和弱毒力的各种HPS血清型，但不会误检猪链球菌2型、猪伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见无关细菌。
3. 一管封闭式，避免了PCR产物对后续PCR的污染。
4. 线性范围广，在10-107拷贝/uL的靶分子浓度范围内均呈线性。
5. 简单快捷，只需要2小时即可得到实验结果。

产品组成：

组分	规格(50T)
即用型荧光PCR Mix	750μl
HPS专一性引物对	100μl
HPS阳性对照	50μl
超纯水	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、样品DNA的制备
用自选方法纯化HPS样品的DNA，也可以另购本公司的柱式细菌DNA提取试剂盒(BTN60802)，跟本试剂盒兼容。

二、制备HPS标准曲线
1. 标记6个离心管，分别为1,2,3,4,5和6号。
2. 用带芯分别加入45μl超纯水（zuì好用带芯枪头，下同）。
3. 在1号管中加入5μl HPS阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟。
4. 换枪头，从1号管中取5μl溶液到2号管中，充分震荡1分钟。
5. 换枪头，从2号管中取5μl溶液到3号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的样品。
6. 从6个管中分别取5μl进行定量PCR（见下步），每个样品zuì好重复3次。

三、荧光定量PCR反应（30μl体系）
7. 在PCR管中加入下列成分（每个样品zuì好重复三次，这里只列出一次）：

成份	样品	6个阳性对照	阴性对照
HPS专一性引物对	2μl	2μl	2μl
样品DNA	5μl	无	无
HPS阳性对照	无	5μl	无
自备1×ROX (见注)	2μl	2μl	2μl
补超纯水到	15μl	15μl	15μl
即用型荧光PCR Mix	15μl	15μl	15μl

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX。此处阴性对照用的是水，用户也可以用其他大肠杆菌基因组DNA做阴性对照。
8. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行定量PCR，反应参数如下：

过程	温度	时间	说明
预变性	95℃	5分钟
PCR反应 (40~50个循环)	95℃	20s	收集荧光数据， 所选择波长见注。
	62℃	20s
	68℃	20s
溶解曲线分析判断 产物特异性	加热到95℃ 10分钟，然后降低到55℃后，按0.5℃/10s的升幅将温 度提高到95℃，其间记录下荧光信号的变化。特异的HPS PCR扩增 产物将在84.5℃产生特异峰。

注：本产品所用荧光染料跟DNA结合时的zuì大光吸收是500 nm，zuì大发射波长是530 nm，不能DNA结合时zuì大吸收波长是471 nm，无发射。

四、数据处理
9. 以HPS阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。本试剂盒提供的阳性对照浓度为XXX拷贝/uL，所以1-6管中的稀释样品浓度可以由此计算出来。再用浓度的的log为横轴，以Ct值为纵轴，通过待测样品的Ct值反推出样品DNA的浓度。
10. 如果没有自己做标准曲线，可以用本试剂的经验标准曲线方程：
  Ct=-3.4logX+25.4
用户将样品所测Ct值放入方程式即可计算出X（样品DNA浓度）。此法不是非常准确，因为仪器型号，试剂，操作误差等都会影响结果。

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