低熔点琼脂糖(Low melting point agarose)是经过改良使得成胶温度和熔点更低的琼脂糖,相比于常规琼脂糖,分子筛特性更好,条带清晰度更高。非常适用于小分子量核酸的分离以及电泳后核酸片段的回收(因其约在65.5℃熔化,几乎低于所有核酸分子的熔点)。低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收的DNA胶条重熔后,可以直接用于制备放射性同位素标记的DNA探针。本品在37℃以下保持流动,适用于凝胶内的酶促反应、组织培养、细胞的克隆和病毒空斑实验等。
使用方法之一:电泳前染色 本方法是在上样时对DNA进行染色,只适于琼脂糖凝胶电泳。
1. 用高纯度的无水DMSO 将10000×的SYBR Green I 稀释100倍成100×电泳前染色液。染色液可以在-20℃和闭光条件下可以保存一个月以上。
2. 按常规方法制备胶,胶的厚度最好不要超过5mm,胶中不能含任何染料。
3. 将100 X电泳前染色液与DNA样品(包括DNA Marker)按1:10的比例混合,室温放置10-15分钟,加上样液后上样。
4.上样后电泳。
5.在300nm的UV下观察。UV的功率最好为90W(15W X 6),手持UV一般功率不够,难以得到满意的灵敏度。除300nm外,SYBR Green I还可以在500nm和380nm的激发光下观察(如使用Dark Reader 蓝色可见光透色仪)。也可以用激光扫描仪记录电泳结果。
6. 用配置了520-550nm 滤光片(一般呈黄色或深黄色)的相机拍照。
注意:不要使用与EB 兼容的红色滤光片(能阻挡520-550nm的光)。如果能再加上能滤去UV的滤光片,效果会更好。
7.后续Southern或Northern转膜或胶回收按常规操作进行。
使用方法之二:电泳中染色 本方法是将SYBR Green I 加入到琼脂糖凝胶中,优点是不需要额外的染色处理,只适于琼脂糖凝胶电泳。
1. 将10000×SYBR Green I 直接加入到融化的、但温度已经降低到50℃左右的琼脂糖凝胶中,使其终浓度在0.5-1X左右,混合均匀后倒胶,厚度最好不要超过5 mm。
2. 按常规方法上样和电泳。
3.电泳后观察和照相处理同方法一。
注意:由于在琼脂糖凝胶中的SYBR Green I在加热融化时会大量分解,所以琼脂糖凝胶最好需要多少配多少。
使用方法之三:电泳后染色 本方法是在电泳后对DNA进行染色,适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE,检测灵敏度可达20 pg DNA,但该方法需要单独的染色处理。
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用pH7.0-8.3的缓冲液(如:TAE,TBE或TE)将10000×SYBR Green I 稀释10000倍成1×电泳后染色液。
3. 将电泳后染色液倒入合适的聚*烯容器中,放入琼脂糖凝胶,用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟。对聚*烯酰胺凝胶,可取下一块玻璃板,然后将配好的电泳后染色液轻轻地倒在PAGE胶板上,让染色液均匀地覆盖整个PAGE胶板,静置染色30分钟。避免让染色液与玻璃表面接触。
4. 观察和照相处理同方法一。
注意:电泳后染色液可以冷冻避光储存一个星期。反复使用次数取决于胶的大小(胶越大,非特异吸附产生的损耗就越大),一般可重复使用4次。
注意事项: 1. 融化:本产品溶于DMSO中,融化时一定要让其彻底融化,否则SYBRGreen I在液相和固相中浓度不均,影响实验的可重复性。
2. 容器:SYBR Green I 对聚*烯材料的亲和力非特意吸附最小,故建议在稀释、贮存、染色等使用过程中使用专用的聚*烯类容器,容器表面会被染成橙色。不要使用玻璃和非聚*烯容器。
3. 反复使用:由于凝胶和容器的非特意吸附,使用过的SYBR Green I 再染色时效率会逐渐降低。
4. 稳定性:稀释后的SYBR Green I工作液体最适保存条件是闭光、密封、低温(4℃)、pH在7.5-8.3。避免将本产品直接加入热的琼脂糖凝胶中,禁止用微波加热处理SYBR Green I。
5. 稀释液:可以用电泳缓冲液稀释SYBR Green I,包括常用的TAE、TBE、TE、SuperBuffer-2等。最好不要使用水和pH7.8(25℃)的Tris缓冲液。后者的pH在4℃时会升高到8.4。
6.其他影响因素:染色液中最好不要有SDS,也不要用去污剂洗涤染色用的聚*烯容器时,0.1-.3% SDS 能抑制SYBR Green I与DNA 结合。用deaza-G 替代G的DNA 不能有效染色。
疑难解答: Q:DNA 条带为何出现弯曲或模糊?
A:DNA 过量,将DNA 用量降低到1-5 ng/条带。电泳时间不要超过2小时,否则SYBR Green I 会从DNA上分离出来,会产生弥散状条带。电压不能太高,否则产热会影响SYBR Green I与DNA的结合。
Q:醇/盐沉淀法能否把结合在DNA上的SYBR Green I 去掉?
A:可以。其中乙醇效果最好,*丙醇次之。但正丁*、氯*和苯*抽提不能去除与DNA 结合的SYBR Green I。
Q:用SYBR Green I 染过的胶能否用于Southern或Northern Blot?
A:可以,但最好在预杂交和杂交溶液中加入0.1%-0.3%的SDS。SDS 能是SYBR Green I与DNA 分开。
Q:能否用SYBR Green I染色膜上的DNA。
A:可以用来染色带正电的尼龙膜上的DNA,不能用于中性尼龙膜和硝酸纤维素膜。