强力生物薄膜DNA提取试剂盒

生物薄膜在很多方面特性与土壤非常类似，如微生物群落混杂、细菌密度差异大、水分含量、化学组成和抑制因子。而富含有腐植酸抑制物、金属离子、盐和大量的多糖，这些方面也很像土壤，并且会影响核酸的提取。然而，生物薄膜和土壤的基本组成成分还是有很大的区别， 所以提取DNA和RNA时，还需要另外加入一些处理手段。

处理生物薄膜前需要考虑的东西:

样品收集:

采集生物薄膜样品可以很简单，刮下岩石上粘滑的一层、切下微生物垫（Microbial Mat）一小块，或连同生物薄膜和生长的基质一起采回来，通过涡旋、研磨均质、超声波或化学/酶处理，分离其中的生物薄膜物质。收集生长在岩石、淋浴莲蓬头、管道、牙齿上的生物薄膜相对比较麻烦点，通常采用超声波、研磨均质或刮取法分离微生物群落。化学和酶处理很少用，因为它们不能适用于所有类型的胞外混合物。

胞外聚合物EPS:

细菌分泌的胞外聚合物不但是结构上的需要，还是抵抗环境压力的利器，同时它也抵抗抗生素或裂解缓冲液的使用。越老越成熟的生物薄膜EPS含量越高，硬度也越大。越粘稠的生物薄膜含有更多的沉积物、盐和矿物沉淀。裂解条件很好的情况下，加样量不用太多。一个地点最好多采几个样，微环境的差异有可能影响微生物种群的结构。较薄的生物薄膜里头微生物相对较少，需要多加样。另外，若生长基质本身比较细腻，可以连同生物薄膜一起放进Bead Beating Tube中进行提取。

裂解:

保证充分的裂解是处理生物薄膜最难的一个部分。微生物垫使用强力的珠磨研磨机可以取得很好的均质效果，而富含EPS的样品经过长时间珠磨研磨后，裂解物会变得非常粘稠。随着研磨时间增加，可转移出来用于下一个步骤的裂解物就大幅减少。最终影响到核酸提取得率。而在涡旋仪上涡旋振荡则不会出现这种请款。使用PowerBiofilm™ 裂解缓冲液处理富含EPS的样品，10min的普通涡旋振荡可以获得高速珠磨研磨机差不多的提取得率。

抑制因子Inhibitors:

就算裂解步骤再成功，也避免不了降解多糖、腐植酸及其它有机/无机成分的污染。其中一个去处降解多糖等物质的办法是在裂解完成后使用IRT技术（抑制因子去除技术）。根据裂解物的颜色和粘稠度（腐植酸等抑制因子水平的指标），IRT的步骤可以做修改。对于比较清亮的裂解物或已知EPS较少的样品（当然，也不那么粘稠），可以减少抑制因子去除溶液的使用量。相反，呈棕色富含大量腐植酸的样品需要更多的抑制因子去除溶液。我们给出了两种抑制因子去除溶液的使用量，因为大量使用来去除抑制因子的同时也会去除掉部分核酸。所以使用适当的溶液量去抑制因子，是获得得率最大化的关键。

提取生物薄膜样品DNA或RNA的几个要点

1）少加样。当使用2ml Bead Tubes小量提取时，加样量控制在0.05-0.2g。有些研究者通过自己实验室长期摸索优化，加样量有达到0.25-0.3g的。使用超过建议加样量常常会导致提不到核酸（见第三点）。建议加样量不是指导范围而是裂解溶液化学物的最优处理范围。过量加样会影响生物薄膜生长基质的去除和细胞裂解。

2）使用试剂盒提供研磨珠套管。PowerBiofilm 的研磨珠套管是经过专门设计适应裂解溶液化学物工作的。它不是简单的研磨珠混搭。外容器Tube本身非常坚硬，可适用于普通的涡旋振荡和强力高速珠磨研磨机，不会中途破裂。请不要把研磨珠转移到其它Tube管中使用。有些人未曾用过不透明的研磨珠套管，不过把离心后碎片等会沉淀下来，转移上清不会很困难。去尝试，如果有困难请随时联系我们。

3）不要超时研磨。使用你实验室常规研磨均质设备和标准设置不一定最好，有可能过分研磨。根据我们的经验，加长样品研磨时间或更大的研磨强度并不能提高得率。随着研磨时间的延长和强度的增加，多糖和其它有机/无机成分容易形成粘稠的裂解物。绝大多数这类物质不可溶，且会吸附核酸，导致核酸丢失。如果研磨完毕可转移的裂解物少于400μl，那么就是研磨太过了。高速研磨30s比较合适。

4）使用适量洗脱液。这条适用于使用二氧化硅滤膜过滤柱进行洗脱。最好的洗脱液体积是100μl。这个量可让核酸充分洗脱下来。均匀加到滤膜上的话，50μl最小量也还能保证核酸洗脱效率，不过100μl能获得最充分洗脱。使用小于50μl会严重影响核酸得率。请记住，稀释的核酸可通过浓缩缩小体积。

5）不要以为所有生物薄膜（biofilm）和生物垫（biomats）都差不多。有些生物薄膜杂质很多微生物很少，得率远没有想象中的那么高。若洗脱后分光光度计测不出来DNA或RNA，加样量没有超出建议值，也没有研磨太过，也许只是核酸浓度非常低。你仍然有可能通过PCR检测得到（见第六点）。若对你的生物薄膜样品不太了解，与预期得率差异很大，请联系我们，或者可以给出更多优化建议。关于一些生物薄膜和生物垫的常规得率，点击这里（biofilm_apnote）。

6）凝胶电泳和PCR共同评估核酸。使用紫外光检测得率，许多因素会影响读数的准确性。腐植酸和污染的RNA可明显推高A260。DNA碎片比完整DNA片段读数要高。凝胶电泳可更好检验分光光度计的结果。因为PowerBiofilm使用了IRT技术（抑制因子去除技术），获得的核酸非常纯净，所以若读数较低，也要比未经有效纯化DNA和RNA得到的结果更准确。如果凝胶电泳看不到条带，尝试PCR扩增。使用了IRT技术的PowerBiofilm Kit能保证扩增的成功率，这点明显区别于其它提取方法。