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- YBio/钰博生物
- YB-742500-15
- 中国
- 2025年07月15日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
Porcine Circovirus(PCV) Probe qPCR Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海钰博生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
Porcine Circovirus(PCV) Probe qPCR Kit
猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）有 PCV-1 和 PCV-2 两种型， 其基因组为单链 DNA，长度分别为 1759nt 和 1768nt，其同源性低于 80%， 但基因组结构相似。PCV-1 无致病性，广泛存在于猪体内。PCV-2 对猪具有较 强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感 染不同年龄的猪。感染病毒后的病猪最常见的症状是猪只渐进性消瘦或生长迟 缓，这也是诊断所必需的临床依据，其他症状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮 肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸障碍，较少发现的症状为腹泻 和中枢神经系统紊乱，一旦感染该病毒，发病率一般很低而病死率都很高，对养 猪业带来较大的经济损失。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发， 专门检测猪圆环病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据猪圆环病毒通用高度保守区设计，不会跟其他病毒的
DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
| 编号 | 成分 | 规格 |
| 试剂一 | 2×Probe qPCR Magic Mix | 500μL（本色盖） |
| 试剂二 | 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL（黄盖） |
| 试剂三 | 猪圆环病毒通用探针法qPCR引物混合液 | 100μL（白盖） |
| 试剂四 | 猪圆环病毒通用qPCR探针 | 50μL（棕色管） |
| 试剂五 | 猪圆环病毒通用qPCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50μL（黄盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期12个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品
（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性对照管 | 标准曲线样品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 猪圆环病毒通用qPCR 探针 | 1μL | 1μL | 各 1μL |
| 猪圆环病毒通用探针法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 个待测 DNA 模板 | 7 μL | 不加 | 不加 |
| 超纯水 | 不加 | 7 μL | 不加 |
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | 不加 | 不加 | 各7μL（2号样到2号管，3 号样到3号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15 sec |
| 60℃ |
1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号） |
|
| 按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | ||
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct
值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品
RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大
于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该
小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小
于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct
值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。
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。临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量PCR诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量PCR技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法].人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南
-A尾巴的RNA分子加上一串A尾巴，然后用带有一段通用序列（universal tag）的Oligo-dT及RT酶来合成cDNA。这样设计的一个好处就是一次RT反应合成了所有miRNA分子以及其他小RNA、mRNA对应的cDNA，接下来想用来检测什么都可以，细细算来省了不少特异引物和多次RT反应的钱呢！整个RT反应操作也是非常简单，加入预先混好的酶，37℃孵育60min，95℃孵育5min即完成cDNA合成。 最后一步就是取出一点cDNA为扩增模板，加入正反引物和real-time PCR 试剂盒
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