热启动Taq DNA聚合酶（含Taq单抗)

特别提示：包括热启动Taq DNA聚合酶（含Taq单抗)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：热启动Taq DNA聚合酶（含Taq单抗)
英文名称：HA HotStart Taq DNA Polymerase
产品货号：WH0090
产品规格：250U|500U

本制品中的HA HotStart Taq DNA Polymerase是Taq DNA Polymerase和其单克隆抗体的混合制品，适用于HotStart PCR实验。在PCR反应高温加热前，Taq单克隆抗体会与Taq酶结合，抑制其聚合酶活性。本产品中高亲和力抗体可以保证在常温条件下完全屏蔽Taq酶活性，使整个反应体系具有很高的特异性。另外，本产品中的Taq DNA Polymerase具有较高的模板亲和力，可以提高扩增的效率以及特异性。10×HA Buffer是特别为该酶所优化的PCR反应缓冲液，可以保证该酶的zuì佳性能。5×Probe qPCR Buffer是特别为探针法定量PCR用户所优化的反应添加剂，在实验中配合10×HA Buffer使用，可使本产品用于探针法定量PCR反应中，从而使得本产品具有更加广泛的应用范围。另外，本制品所产生的PCR产物3′末端为A，可直接用TA载体克隆。

·高亲和体系：HA HotStart Taq是特异性抗体修饰的热启动型DNA聚合酶，其抗体亲和力高；同时Taq DNA Polymerase具有较高的模板亲和力，具有稳定的扩增效率，和高的特异性；该酶配合精心优化的Buffer体系，使得PCR反应同时具有灵敏度高的优点。
·稳定性强：对于复杂模板，低拷贝模板的PCR反应以及多重PCR反应等普通DNA聚合酶无法完成的实验，本产品都具有较高的反应成功率。
·应用广泛：本产品不但适用于普通PCR分析，还适用于定量PCR分析。

产品组成：

组分	WH0090-1	WH0090-2
HA HotStart Taq DNA Polymerase（5U/μl)	250U	500U
10×HA Buffer	1.8ml	1.8ml
5×Probe qPCR Buffer	1 ml	2×1ml

保存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃保存。在-20℃条件下，本产品可保存1年。从-20℃取出使用时，将冻存的10 × HA Buffer和5 × Probe qPCR Buffer融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如需一段时间内经常取用，可在2-8℃条件下储存3个月，但要避免反复多次冻融。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1．在进行普通PCR反应和染料法定量PCR反应时，不需要额外的加入5×Probe qPCR Buffer，只有在进行探针法定量PCR时才需要额外加入5×Probe qPCR Buffer。
2．在进行探针法定量PCR时，引物终浓度为250 nM，探针终浓度为200 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化引物浓度的，可以在50-900 nM范围内调整；需要进一步优化探针浓度的，可以在100-500 nM范围内调整。

活性定义：
1单位（U）HA HotStart Taq活力定义为在74℃、3min内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，将10nmol的脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。

质量控制：
SDS-PAGE检测纯度大于99%；经检测无外源核酸酶活性；能有效地扩增人基因组中的单基因；室温存放一周，无明显活性改变。

适用范围：
适于常规PCR反应，复杂模板，低拷贝模板等的扩增；多重PCR实验，定量PCR实验等。

操作步骤：

一、普通PCR反应体系：

  注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定zuì佳反应条件。
1．使用HA HotStart Taq，以人类基因组DNA为模板，扩增1000 bp的片段。
2．按照下表中各组分的加入量进行反应液的配制。

加入物	50μl体系	20μl体系	终浓度
DNA Template	－	－	<200ng
dNTPs（2.5mM，each）	4.0μl	1.6μl	200nM
正向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM
反向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM
10×HA Buffer	5.0μl	2.0μl	1×
HA HotStart Taq酶（5U/μl)	0.5μl	0.2μl	0.05U/μl
RNase-Free ddH2O	至50μl	至20μl	－

3．按照下表设置PCR反应程序。

阶段	循环	温度	时间	内容
预变性	1×	95℃	3～5min	预变性
PCR反应	35～40×	94℃	15sec	变性
		60℃	20sec	退火
		72℃	1min	延伸
补充延伸	1×	72℃	5min	补充延伸

4．结果检测：反应结束后取10μl反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
  备注：实验结果表明，反复冻融的DNA模板会影响扩增，尽量不要将DNA模板进行反复冻融；需要多次实验的模板，可分装后进行冻存，以减少冻融次数。


二、染料法Real-Time PCR反应体系：
1．将反应所需各组分解冻，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。

加入物	50μl体系	20μl体系	终浓度
Template	－	－	－*1
dNTPs（2.5mM，each）	4.0μl	1.6μl	200nM
正向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM*2
反向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM*2
10×HA Buffer	5.0μl	2.0μl	1×
HA HotStart Taq酶（5U/μl)	0.5μl	0.2μl	0.05U/μl
20×SYBR Solution	2.5μl	1.0μl	1×
50×ROX Reference Dye*3	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至50μl	至20μl	－

  *1当模板为基因组DNA时模板量为50~100ng，当模板为cDNA时，模板量不超过PCR反应体系的1/10。
  *2引物终浓度为250 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在50-900 nM范围内调整。
  *3几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度见下表：

仪器	终浓度
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等	2.5×（例如：2.5 μl ROX/50 μl体系)
ABI 7500、7500 Fast； Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等	0.5×（例如：0.5 μl ROX/50 μl体系)
Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等	不用添加

3．按照下表设置PCR反应程序。

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	3～5min	预变性	否
PCR反应	40～45×	95℃	15sec	变性	否
		60℃	30sec	退火/延伸	是
熔解曲线	1×	65～95℃	－	熔解曲线	是

4．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有反应液均在管底。
5．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。
6．实验结果分析：反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和熔解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

三、探针法Real-Time PCR反应体系：
1．将反应所需各组分解冻，并将其彻底混匀。
2．建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。

加入物	50μl体系	20μl体系	终浓度
Template	－	－	－*1
dNTPs（2.5mM，each）	4.0μl	1.6μl	200nM
正向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM*2
反向引物（10μM）	1.25μl	0.5μl	250nM*2
荧光探针（10μM）	1.0μl	0.4μl	200nM*3
10×HA Buffer	5.0μl	2.0μl	1×
5×Probe qPCR Buffer	10μl	4.0μl	1×
HA HotStart Taq酶（5U/μl）	0.5μl	0.2μl	0.05U/μl
50×ROX Reference Dye*4	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至50μl	至20μl	－

  *1当模板为基因组DNA时模板量为50~100ng，当模板为cDNA时，模板量不超过PCR反应体系的1/10。
  *2引物终浓度为250 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在50-900 nM范围内调整。
  *3探针的浓度与使用的Real-Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用说明进行。通常探针终浓度为200 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化探针浓度的，可以在100-500 nM范围内调整。
  *4关于ROX Reference Dye的使用请参考染料法Real-Time PCR反应体系。
3．进行Real-time PCR反应
  建议采用两步法PCR反应程序进行反应。变性时间可在5-15 sec范围内进行调整，退火/延伸时间可在20-32 sec范围内进行调整
  两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	3～5min	预变性	否
PCR反应	40～45×	95℃	5-15sec*1	变性	否
		60℃	15-32sec*2	退火/延伸	是

  *1使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时可设定为5 sec。
  *2使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。
  几种常见仪器的时间设定如下：
  使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在20 sec。
  使用Roche LightCycler/LightCycler 480，ABI 7500 Fast时请设定在15 sec。
  使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
  使用ABI7500时请设定在32 sec。
4．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有反应液均在管底。
5．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。
6．实验结果分析。

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