- ￥2490
- 康朗生物
- 中国/德国
- KL16-4KL1700
- 2025年07月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
‘-20℃保存
- 保质期：
有效期一年
- 库存：
30
- 供应商：
上海康朗生物科技有限公司
- 规格：
50次
PCR使用方法：
2. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的 DNA 释放剂试用装。则按下面步骤操作：
3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足够 10 个样品）为例：在一干净塑料
管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超纯水，充分混合均匀即可。溶液 A 工作液可室温放置，但最好在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足够 10 个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液 A 工作液的体积需要做相应的调整。
4. 在标记好的 N+2 个离心管中，加入 1-5mg 固体样品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液体样品（如牛奶）待测样品。在样品制备阳性对照中加入 5uL 阳性对照，在样品制备阴性对照中加入 5uL 水。
5. 在每个管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。
6. 95℃保温 10 分钟。
7. 待冷却到常温后加入 10uL 溶液 B 并混匀得 DNA 释放液。每个样品得到的 DNA释放液足够进行 50-100 次 PCR。
二、设置 PCR 反应（40 uL 体系）
8. 在 N+2 个 PCR 管中加入下列成分，下面以样品数为 1 举例（注意：如果第一次使用DNA 释放剂，最好每个样品设置两个模板用量的 PCR 反应，两个反应的模板使用量差 10 倍，由此确定最佳用量，以后就用效果好的那个模板用量）：
| 成份 | 样品（用量1） | 样品（用量2） | 阳性对照 | 阴性对照 |
| 即用型 PCR Mix 3.0 | 20 uL | 20 uL | 20 uL | 20 uL |
| PCR 引物混合液 | 2 uL | 2 uL | 2 uL | 2 uL |
| 制备的样品 | 18 uL | 2 uL | 无 | 无 |
| 样品制备阳性对照 | 不加 | 不加 | 2 uL | 不加 |
| 样品制备阴性对照 | 不加 | 不加 | 不加 | 2 uL |
| 超纯水 | 不加 | 16 uL | 16 uL | 16 uL |
9. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行 PCR。
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 94℃ | 10分钟 |
| PCR 反应 （35 个循环） |
94℃ | 45s |
| 56℃ | 45s | |
| 72℃ | 45s | |
| 延伸 | 72℃ | 5分 |
10. 电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix 在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。预期的 PCR 产物长度为 121bp。阳性对照必须有此条带出现，阴性对照必须无任何扩增
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文献和实验品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。 3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统
结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。 3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统的终点定量PCR 大约250倍。在理论上，只要设计的引物
或质谱的方法。4、问：我在做shRNA质粒，用lipo2000转染U251细胞。这两天做了一次，用RT-PCR来看转染后抑制的效果。公司给我四个质粒、一个阳性对照、一个阴性对照。按照lipo的protocol，DNA：lipo比例为1：3，转染近30个小时提的RNA。结果出来让我有点茫然，四个质粒确实有抑制，抑制率大约在50%左右。但是问题出来了，阳性对照是针对GAPDH的，但是我阳性对照的GAPDH跑出来条带非常亮，而阴性对照却基本没有GAPDH。应该不是加样加错了？楼主能不能帮我分析一下？
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