漆酶活性检测试剂盒 微量法

漆酶活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC1635
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体110 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体20 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×2瓶	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 工作液的配制：一瓶试剂二用10 mL试剂一溶解。现用现配。

产品说明：
漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一种环保型酶，其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。
漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水，水浴锅
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）   
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3、培养液：直接检测。
二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 水浴锅温度调至45℃。
3. 操作表：在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂：

 

试剂名称	测定管	空白管
样本（μL）	30	-
蒸馏水（μL）	-	30
工作液（μL）	170	170
在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入上述试剂，充分混匀后于420nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于45℃水浴3min，拿出迅速擦干测定190s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A2测定-A1测定，ΔA空白管=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

注意事项：
1、工作液需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。
2、测定前进行预实验，若吸光值较高，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，OD值变化不超过0.05。
实验实例：

1. 取0.1g香菇加1mL提取液进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.8963-0.1004=0.7959，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0729-0.0542=0.0187，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.7959-0.0187=0.7772，按样本质量计算酶活得：

漆酶酶活（U/g 质量）=61.7×ΔA÷W=61.7×0.7772÷0.1=479.53 U/g 质量。
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