过氧化氢测定盒 微量法

过氧化氢（H₂O₂）含量检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC3595
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	液体100 mL×1瓶（自备）	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体6 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体30 mL×1瓶	2-8℃保存
标准品	液体1 mL×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂一：*自备。
2. 试剂二：临用前加入3 mL浓盐酸充分溶解备用，用不完的试剂2-8℃保存。
3. 标准品：1 mmol/mL H₂O₂标准液。

产品说明：
H₂O₂是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H₂O₂也是许多氧化应激反应中的关键调节因子。
H₂O₂与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。
技术指标：
最低检出限：0.0027 μmol/mL
线性范围：0.0195-3 μmol/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、*、浓盐酸、研钵/匀浆器和冰。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织样本的制备：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：按照每100μL血清（浆）加入0.9mL试剂一的比例充分混匀；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至415nm，蒸馏水调零。
2. 将试剂二、三和四37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
3. 如果用96孔板将则用*将1mmol/mL标准液稀释为2μmol/mL的标准溶液，用微量玻璃比色皿则用*将1mmol/mL标准液稀释为1μmol/mL的标准溶液。
4. 在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管	标准管	空白管
样本	250
标准溶液		250
试剂一			250
试剂二	25	25	25
试剂三	50	50	50
4000g，常温离心10min，弃上清，留沉淀（可先用*清洗3-5次来洗去植物色素）
试剂四	250	250	250

加入试剂四，充分震荡溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL转移至微量玻璃比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值（空白管只要做1-2次即可）。计算∆A测定=A测定管-A空白管，∆A标准=A标准管-A空白管。
三、H₂O₂含量计算
A、按96孔板计算
1、按照细菌、细胞数量计算：
H₂O₂含量（μmol/10⁴ cell）=∆A测定÷(∆A标准÷C标液)×V样本÷(500×V样本÷V提取)=0.004×∆A测定÷∆A标准
2、按组织质量计算：
H₂O₂含量（μmol/g 质量）=∆A测定÷（∆A标准÷C标液）×V样本÷(V样本÷V提取×W)=2×∆A测定÷∆A标准÷W
3、按照蛋白浓度计算：
H₂O₂含量（μmol/mg prot）=∆A测定÷（∆A标准÷C标液）×V样本÷（Cpr×V样本）=2×∆A测定÷∆A标准÷Cpr
4、按血清（浆）体积计算：
H₂O₂含量(μmol/mL)=∆A测定÷（∆A标准÷C标液）×10=20×∆A测定÷∆A标准
500：细胞或细菌总数，万个；C标液：H₂O₂标准溶液浓度，2μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.25mL；W：组织质量，g；V提取：提取过程中所用体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；10：血清稀释倍数，[0.1mL血清（浆）+0.9mL试剂一] ÷0.1mL血清（浆）=10。
B、按微量玻璃比色皿计算
将公式中的C标液-2μmol/mL改为C标液-1μmol/mL进行计算即可。
注意事项：

1. 由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。

 

1. 本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。
2. 如果样本吸光值大于1.1，建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
3. 试剂一会使蛋白变性，若按蛋白浓度计算需要另提组织重新测定蛋白浓度

实验实例：

1. 取0.1g心脏，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取全部上清液（注意吸取干净），置冰上，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A测定=A测定管-A空白管=0.083-0.046=0.039，∆A标准=A标准管-A空白管=0.824-0.046=0.778，按样本质量计算含量得：

H₂O₂含量（μmol/g质量）=2×∆A测定÷∆A标准÷W=1 μmol/g质量。

1. 取0.1g茶叶，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取全部上清液（注意吸取干净），置冰上，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A测定=A测定管-A空白管=0.221-0.046=0.175，∆A标准=A标准管-A空白管=0.824-0.046=0.778，按样本质量计算含量得：

H₂O₂含量（μmol/g质量）=2×∆A测定÷∆A标准÷W=4.5 μmol/g质量。
相关发表文献：

1. Yanan Wang,Chengzhen Liang,Zhigang Meng,et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019;162:364-373.(IF3.712)
2. Xuechan Tang,Xiaoli Xie,Xin Wang,et al. The Combination of piR-823 and Eukaryotic Initiation Factor 3 B (EIF3B) Activates Hepatic Stellate Cells via Upregulating TGF-β1 in Liver Fibrogenesis. International Medical Journal of Experimental. December 2018;(IF1.420)
3. Ying Zhao,Wengang Yu,Xiangyu Hu,et al. Physiological and transcriptomic analysis revealed the involvement of crucial factors in heat stress response of Rhododendron hainanense. Gene. June 2018;(IF2.638)
4. Lifang Lv,Tianyu Li,Xuelian Li,et al. The lncRNA Plscr4 Controls Cardiac Hypertrophy by Regulating miR-214. Molecular Therapy Nucleic Acids. March 2018;(IF5.919)
5. Moxian Chen,Fuyuan Zhu,Fengzhu Wang,et al. Alternative splicing and translation play important roles in hypoxic germination in rice. Journal of Experimental Botany. January 2019;(IF5.36)
6. Bingbing Cai,Qiang Li,Fengjiao Liu,et al. Decreasing fructose 1,6-bisphosphate aldolase activity reduces plant growth and tolerance to chilling stress in tomato seedlings. Physiologia Plantarum. December 2017;(IF3)
7.  Xiaorong Guo,Junfeng Niu,Xiaoyan Cao. Heterologous Expression of Salvia miltiorrhiza MicroRNA408 Enhances Tolerance to Salt Stress in Nicotiana benthamiana. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

参考文献：
[1] Satterfield C N, Bonnell A H. Interferences in titanium sulfate method for hydrogen peroxide[J]. Analytical Chemistry, 1955, 27(7): 1174-1175.
[2] Amin V M, Olson N F. Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide in milk[J]. Journal of Dairy Science, 1967, 50(4): 461-464