α-半乳糖苷酶（α-GAL）测试盒 微量法

α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2575
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体100 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	粉剂×2支	-20℃保存
试剂二	液体4 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体15 mL×1瓶	2-8℃保存
标准品	液体1 mL×1支	2-8℃保存

溶液的配制：
1、试剂一：临用前取1支加入1.25 mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融（1瓶粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1瓶粉剂）；
2、标准品：5 μmol/mL的对硝基 苯 酚溶液。
产品说明：
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α-半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-GAL分解对-硝基 苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基 苯 酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。
 

• 测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 标准液的稀释：将标准液用蒸馏水稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3. 标准液稀释可参考下表：

序号	稀释前浓度（nmol/mL）	标准液体积（µL）	蒸馏水体积（µL）	稀释后浓度（nmol/mL）
1	5000	80	1920	200
2	200	1000	1000	100
3	100	1000	1000	50
4	50	1000	1000	25
5	25	1000	1000	12.5
6	12.5	1000	1000	6.25
7	6.25	0	1000	0（空白管）

备注：实验中每个标准管需70µL标准溶液。

1. 样本测定（在EP管或96孔板中依次加入下列试剂）：

试剂名称（μL）	测定管	对照管	标准管
试剂一	25	-	-
蒸馏水	-	25	-
试剂二	35	35	-
样本	10	10	-
迅速混匀，放入37℃水浴锅/恒温培养箱中准确反应30min
标准品	-	-	70
试剂三	130	130	130
充分混匀，室温静置2min后，于400nm处测定吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。

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