辛基-琼脂糖凝胶4FF

特别提示：包括辛基-琼脂糖凝胶4FF在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：辛基-琼脂糖凝胶4FF
英文名称：Octyl-Sepharose 4FF
产品货号：QN4089
产品规格：25ml

辛基-琼脂糖凝胶4FF是将辛基键合在琼脂糖凝胶上形成的一种可利用疏水作用来实现目标产品纯化分离的中等疏水类介质。适合各种蛋白的分离和纯化。具有流速快，使用方便，应用广泛的特点。

技术参数：
基质：6%交联琼脂糖凝胶
配基：*丁烷基n-Octyl
配基密度：5μmol/mL
颗粒大小：45～165μm
zuì大流速：600cm/h
工作pH：pH3.0～13.0
操作温度：室温
储存条件：4～28℃

使用方法：
1．装柱
① 将所有的试剂和填料达到室温.配制初始缓冲液(平衡液)和缓冲液。
② 根据柱子大小取所需凝胶的量，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶:缓冲液=3:1比例）配成匀浆。
③ 将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液体（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。
④ 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意不要使用气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
⑤ 打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
2．平衡
  让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡缓冲液一般是高盐浓度的缓冲液，如：0.02～0.05mol/L的PBS加1～2.5mol/L(NH4)2SO4等。
3．上样
① 样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心、过滤后上柱；
② 一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡洗液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。
③ 介质对样品组分吸附的程度取决于样品的疏水性质、流动相的离子强度和温度。温度越大、盐浓度越高或样品组分疏水性越强，介质对组分吸附越牢。
4．洗脱
  疏水介质可用减小盐浓度进行洗脱。加表面活性剂或者有机溶剂可加强洗脱。zuì常用的洗脱液是低盐浓度缓冲液，如：0.02～0.05mol/L的PBS。
5．再生
  一般用低盐浓度的缓冲液洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。若有失活的蛋白或者脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。
6．在位清洗
① 对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2M NaCl去除。
② 对沉淀蛋白、以疏水作用结合的蛋白或者脂类物质，可用1M  NaOH去除。
③ 对强疏水性结合的蛋白、脂类等，可用4～10倍柱体积的70%乙醇或30%异bǐng醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。
  清洗完毕后，用至少3倍柱体积缓冲液平衡柱子。
7．去热源
  用0.5M的氢*化钠清洗柱子5～6小时或者用0.1M的氢*化钠24小时。或用以下步骤去除：
① 2倍柱体积的70%的乙醇；
（2)2倍柱体积50mM Tris-HCl pH7.5
③ 1倍柱体积4M尿素
④ 3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1M NaCl;
  以上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。
8．消毒
  用0.5～1.0M NaOH室温下洗8～10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。

注意事项：
1．密封贮存于4～28℃（保存溶液为20%乙醇+0.1M醋酸钠），通风、干燥的地方，不能冷冻。用过的柱子贮存于4℃（20%乙醇）。
2．在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。

除了辛基-琼脂糖凝胶4FF,，我公司还供应以下相关产品：



名称：DEAE-葡聚糖凝胶A-25
货号：QN3990
规格：25g|100g|500g

名称：聚酰胺(14～30目)
货号：QN3995
规格：500g

名称：镍-琼脂糖凝胶6FF
货号：QN4044
规格：5ml|10ml|25ml|100ml
Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得.它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力，可达5-20mg/ml。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95％。Ni-NTA可再生4-6次，重复使用。本产品悬浮液为20％乙醇，已螯合Ni2+。操作方法：

别名：镍-琼脂糖凝胶6FF镍琼脂糖凝胶镍柱
储存条件：4℃保存，有效期至少一年

A.非变性条件下抽提His标签蛋白

1)准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2操作。

2)加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1mM现用现加。

3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。

4)加入10% Triton X-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟。

5)12000 rpm/min(20,000×g以上)，4℃离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

6)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。

7)将样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的结合情况。

8)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9)分别用5倍NTA体积的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

10)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。zuì为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

11)纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。NTA-0、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分别为浓度20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.变性条件下从包涵体中纯化His标签蛋白

1)准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2操作。

2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1mM现用现加。

3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。

4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。

5)12000转/分（20,000×g以上），4℃离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

6)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。

7)将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

8)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9)分别用5倍NTA体积GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脱，流速在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

10)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。zuì为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

11)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。

12)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则。

GuNTA-0、20、40、60、100、500Buffer分别为浓度20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C.NTA树脂的再生

NTA树脂在使用若干次数（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。

NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一步再生溶液流干后，再加下一步再生溶解。

用户需要自行准备25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去离子水。从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I、2倍体积的去离子水、3倍体积的Stripping Solution II、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的75%乙醇、5倍体积的100%乙醇、1倍体积的75%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的去离子水、5倍体积的Stripping Solution III、3倍体积的去离子水分别洗一遍。

如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4℃保存，使用前用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl,0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA,pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4