- ¥1000
- 钦诚生物
- 上海
- QC0330
- 2025年07月14日
企业认证
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
负20度
- 保质期：
2年
- 供应商：
钦诚生物
- 规格：
5ug
基本信息
| 原核抗性: | 氯霉素Chl |
|---|---|
| 克隆菌株: | 大肠杆菌DH5α |
| 培养条件: | 30℃ |
质粒简介
市面上没有见到可进行原核表达Cre酶的温敏质粒（温敏即意味着可以和pKD46一样进行质粒消除）。此质粒由pCP20改造而成，包含其Ori和Cm抗性基因。Cre基因由弱化的LacUV5启动子控制，于1mM ITPG诱导下过夜即可消除基因组中的抗性基因。（试管中长到OD600=0.6-0.8开始诱导，过夜后LB平板划线，挑单菌落验证抗性丢失）此质粒为低拷贝质粒，用试剂盒提质粒时，10ml菌液提质粒，过1个柱子，用50ul水收集，可以看到条带。普通通量的提质粒不易看到条带。
质粒图谱
pCP-Cre大肠敲除质粒使用说明：
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；
3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；
4、42℃热激90s，再冰浴2min；
5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；
6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；
8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。
pCP-Cre大肠敲除质粒注意事项：
1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。
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文献和实验和RecBCD蛋白组成，在基因敲除时必须以环状质粒存在）、结合转化敲除系统及温度敏感型质粒敲除系统等可供选择。 2 FLP-FRT系统和Cre-loxP系统 这两个系统都是位点特异性重组酶系统，其中FLP-FRT源于酿酒酵母，Cre-loxP源于F1噬菌体。两个系统的基本原理类似。以Cre-loxP系统为例，该系统含有两种成分：第一个部分是一段长34 bp的重组酶识别的DNA序列（loxP），其中含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列；第二个是Cre
min。注：平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。四、 转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后，直接提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。
结构具有质粒的基本元件和抗性基因，则可在用其转化大肠杆菌后形成抗性菌落。如果两个loxP位点反向排列，Cre则诱发倒位反应。在不同的DNA分子上，Cre则介导缺失、重复、插入以及易位等反应。 Cre/LoxP位点特异性重组系统也是由穿梭载体和骨架载体构成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。将穿梭载体与骨架载体共转染包装细胞株（293、911以及PERC6等），骨架载体所携带的Cre基因开始表达，介导两个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架
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