Arabinose诱导表达载体pBAD

概述

 

pBAD载体系统是用于在细菌中表达重组蛋白的可靠且可控的系统，该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢。将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游，当L-阿拉伯糖存在时，araBAD启动子驱动目的基因的高效表达；当葡萄糖存在时，目的基因的表达则被抑制。该载体系统可精确控制目的基因的表达，特别适用于生产困难蛋白，如具有毒性或不溶性蛋白。

关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。

参考文献	主题
J Bacteriol. 177:4121-30 (1995)	Development of pBAD vectors

 

亮点

 

首先，将目的基因克隆到pBAD载体上，并将携带该质粒的菌株在缺乏L-阿拉伯糖的生长培养基中培养以降低质粒不稳定性。然后，通过向培养基中加入L-阿拉伯糖来诱导目的基因的表达。

我们的pBAD载体上携带的双向araBAD启动子可同时驱动目的基因和调节蛋白AraC的表达。在缺少L-阿拉伯糖的情况下，AraC在启动子区域二聚化形成环阻断转录。当添加L-阿拉伯糖时，AraC改变构象并结合到启动子中的替代位点，从而激活转录。

向生长培养基中添加葡萄糖，宿主细胞cAMP水平降低，可以进一步抑制目的基因的本底表达。在无葡萄糖的培养基中，cAMP水平很高，cAMP-CRP（代谢物激活蛋白）复合物会与pBAD启动子结合，从而抑制目的基因的表达，这将有利于表达具有细胞毒性或抑制细菌生长的目的基因的表达。

所有定制的pBAD载体都会克隆在能够保持质粒稳定的大肠杆菌中（如Stbl3），可将质粒转移至缺乏L-阿拉伯糖分解代谢基因的宿主菌株（如TOP10）中，使目的基因有效且稳定的表达，因为L-阿拉伯糖的浓度不会随着时间的推移降低。对于需要利用葡萄糖严格抑制本底表达的，则应该使用LMG194宿主菌株。该菌株能够在基础培养基（RM培养基）上生长，可通过葡萄糖进一步抑制araBAD启动子。

 

优势

 

表达高度严谨：pBAD载体系统比pET载体系统的表达更严谨。在缺少L-阿拉伯糖的情况下，目的基因可能只有非常低的本底表达，但可通过葡萄糖进一步抑制。

诱导强度高：araBAD操纵子系统是高度可诱导的。在去除葡萄糖并添加L-阿拉伯糖后，可实现>1000倍的诱导效率。

诱导成本低：L-阿拉伯糖价格低廉，大规模蛋白表达经济实惠。

宿主要求：与pET载体不同，pBAD载体可以稳定存在于表达菌株中，如TOP10。

 

不足之处

 

表达水平次于pET载体：基于pBAD载体系统的重组蛋白水平低于pET载体系统。

诱导物代谢：野生型大肠杆菌可分解L-阿拉伯糖。当表达目的蛋白时，应该使用L-阿拉伯糖分解代谢突变的宿主菌株（如TOP10或LMG194），以避免由于培养基中L-阿拉伯糖的降解而引起表达不稳定。