克隆载体产品及特点: 本产品是在xuanya克必隆G载体的基础上开发的专门用于高效快速克隆平末端 DNA 片段的专用载体,它是由 Sma I 酶切克必隆 G 载体后经过纯化得到的即用型线性载体。跟克必隆 G 载体一样,本产品带有自杀基因,Sma I 位点位于该基因之中,只有当外源平末端 DNA 插入片段插入Sma I 位点,连接后的DNA转化的细胞才能生长,所以最后得到的转化子几乎都是含有平末端 DNA 插入片段的重组子。 1. 即用性,可以直接用于连接反应,免去繁琐的酶切,电泳检测,纯化,去磷酸化,再纯化等步骤。 2. 具有克必隆-G 载体的所有优点,包括零背景,适用于所有 E.Coli 菌株,多拷贝的 colEI 型复制起始位点。 3. 高效率,由于自杀基因的使用有效地减除了载体自身环化对平末端DNA 克隆的影响,自身环化得到的转化子在有选择液存在时只占总转化子的 1%-5%。 4. 应用广泛,可用于克隆酶切产生的平末端 DNA,Pfu 酶扩增的 PCR片段,cDNA 片段,3'和 5'RACE 片段, Taq 酶扩增的 PCR 片段(部分为平末端)。
克隆载体使用方法 1. 连接反应 a. 取新的经过灭菌处理的 0.5 ml Eppendorf 管, 编号。 b. 将 100 ng 载体 DNA 转移到无菌离心管中,加两倍摩尔量的外源DNA 片段,折合成重量(ng) = (外源 DNA 片段 bp 数 X 100 ng X2)/5330 bp (载体 DNA 长度) c. 加蒸馏水至体积为 8 µl,于 45℃保温 5 分钟,使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至 0℃。平末端 DNA 片段的克隆可以省去45℃保温 5 分钟这一步。 d. 加入 10×T4 DNA ligase buffer 1µl, T4 DNA ligase 0.5 µl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于 16℃保温 1-24 小时。 e. 同时做只有外源 DNA 片段没有质粒载体的组对照反应。没有必要做只有质粒载体而无外源 DNA 的对照组,因为自身环化的载体不能生长, 能够生长的转化子基本上是两个载体分子相互连接 形成的新载体。但在有两倍于外源 DNA 片段存在的情况下,两个载体分子连接的机率很小。 2. E. coli 感受态细胞的转化 a. 各取每组连接反应液 2 µl 按标准方法转化 E. coli 感受态细胞。 b. 每组连接反应转化原液取 100 µl 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。