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- XY-TE-1013
- 2025年11月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
Saccharomyces cerevisiae SMD1168
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
EBY100 是酿酒酵母菌株，属于真核细胞，具有氨苄和卡那霉素抗性。 质粒转化条件为电转化，应用于酵母表面展示。此菌株必须生长在营养丰富的 培养基中，例如 YPD 培养基，无法在 minimal media 中生长。在 GAL1 启 动子的作用下，此菌株能够表达 AGA1 基因。EBY100 的配套载体是 pYD1 载体。
此菌株的基因型如下：MATα ura3-52 trp1 leu2∆1 his3∆200 pep4::HIS3 prb1∆1.6R can1 GAL (pIU211: URA3)。
SMD1168酵母菌种运输及保存：
低温运输，-80℃保存，有效期一年。
自备试剂：YPD 培养基、TE 缓冲液（pH 7.5）、乙酸锂、DTT、山梨醇、超纯水等
SMD1168酵母菌种使用方法
本手册提供一个质粒转化酵母的电转化方法，供参考。
一、感受态细胞制备
1. 挑一环酵母菌接种于 5 mL YPD 培养基中，30℃、250-300 rpm 培养 过夜；
2. 取适量的过夜培养液分别接种于两瓶 50 mL YPD 培养基中，30℃、 250-300 rpm 培养约 16-18 小时（OD：1.3-1.5）；
3. 于 4℃，4000 g 离心收集菌体，用 25 mL 冰浴的无菌水洗涤一次后，细胞用 10 mL 冰浴的无菌水重悬，可换成较小的离心管；
4. 加入 1 mL 的 10×TE 缓冲液（pH 7.5），摇晃均匀，再加入 1 mL 10 ×乙酸锂，旋转摇匀，于 30℃轻轻摇动 45 分钟；
5. 再加入 0.4 mL 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于 30℃轻轻摇动 15 分钟；
6. 于 4℃，4000-6000 g 离心，弃上清（用枪吸），再用 25 mL 冰浴的无 菌水洗涤后 4℃离心，收集菌体；
7. 用 2.5 mL 冰冷的 1 mol/L 山梨醇重悬细胞，离心收集菌体，弃上清（用 枪吸）；
8. 每管用 100 uL 1 mol/L 的山梨醇溶解，分装于 EP 管中（80 uL/管）， 于-70℃冰箱保存。
SMD1168酵母菌种二、电转化
1. 向感受态细胞中加入约 5～10 ug（体积小于 10 uL）的 DNA，用枪吹 吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置 5 分钟；
2. 擦干电转杯，电击，电击参数：1.5 KV，25 uF，200 欧姆（详细请参 考电穿孔仪的说明书）；
3. 立即加入 1 mL 预冷的 1 mol/L 山梨醇，轻轻吹吸混匀，转移至 EP 管 中，于 30℃静置 1 小时；
4. 离心，弃上清，加入 1 mL YPD 后，于 30℃、200 rpm 培养 2 小时；
5. 离心得菌体后，吸除 550 uL 上清液，然后按 150 uL/板在相应的选择 培养基平板，于 30℃培养 3-6 天，直到平板上出现菌落。
（注：酿酒酵母适宜的生长温度是 30℃，温度超过 32℃可能导致细胞的死亡。）
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| DNA 快速连接试剂盒 |
| DNA 快速连接试剂盒 |
| 一站式 TA 克隆试剂盒 |
| 一站式 TA 克隆试剂盒 ( 含感受态 ) |
| 一站式平末端克隆试剂盒 |
| 克必隆平末端克隆试剂盒（组成型） |
| 小 RNA 克隆试剂盒 |
| 通用 miRNA 克隆接头 |
| 克必隆常态转化液 |
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| 超级培养基 |
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文献和实验和Pichia 2个种属，共有30余种［8］，其中尤以P.pastoris发展最快，研究最清楚。目前，用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建，主要有：Y11430，MG1003，GS115，KM71和SMD1168，其中Y11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型，GS115有完整的aox1基因，在甲醇培养基上表型为Mut+，当用重组表达载体转化后，由于表达载体线化所用酶不同，其转化子表型可能是Mut+或Muts，可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定；KM71的aox
降解现象的原因就在于此。改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。 另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。 在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢
醇的培养基上生长。最近，人们新推出了一类蛋白酶缺失型菌株，如SMD1163(his4 pep4 prb1)、SMD1165(his4 prb1)和SMD1168(his4 pep4)，解决了降解所造成的表达产物不均一性问题。但是，蛋白酶缺失型菌株生长缓慢，导致外源蛋白质产量上不去。 巴斯德毕赤酵母包括自我复制型游离载体和整合型载体，前者极不稳定，因此一般采用整合型载体。整合型载体含有一个启动子、相应的转录终止密码、筛选标记、抗生素抗性基因、在细菌中进行拷贝增殖所必需的序列以及3 ‘AOX1非编码区序列P
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