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- xuanya
- 美国/中国
- XY-TE-0774
- 2025年11月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 英文名：
SP6 in vitro Transcription Kit
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本试剂盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有 SP6 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 SP6 启动子下游开始合成与模版 DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列 特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 SP6 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实 验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的最佳长度在 20nt 到 2000 nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。
SP6体外转录试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要自备 RNase-free DNase、Tris 饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）
SP6体外转录试剂盒使用方法
一、制备 DNA 模板 PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性 内切酶切成线状。
二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 SP6 启动子。如 果模板是 PCR 产物，则可以在设计引物时将 SP6 启动子序列（5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3’）加上，转录其实是从 3 端 G AGN G 中 的第一个 G 开始。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 SP6 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 SP6 启动子下游。
三是需要转录的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如选择了 Pst I 来线性化质粒），则最好用 T4 DNA 聚合酶修平。
四是必须保证 DNA 模板 中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A， 因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采 取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳 检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序 加入下列成分：
SP6体外转录试剂盒注：此为 20 uL 反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按 比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要单独订购 NTP 分开的试剂盒。 如果需要得到加帽 RNA，则需要另外加入自备的加帽修饰核苷酸（可以从 NEB 购买）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 SP6 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存或立即使用。
注：若需进一步去除 DNA 模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买， 本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase（ 3-5 U/uL）。
2. 37℃保温 15-30 分钟降解 DNA。
3. 补水到 100 uL（体积太小不方便下步的酚氯仿抽提）。
4. 用等体积（100uL）的 Tris 饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂（用前需要摇晃 混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃长期保存。
SP6体外转录试剂盒答客问
1、没有 RNA 产物。最常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模 板 DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor 用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。最常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的第一个和第二个碱 基最好都是 G，在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。 可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依 赖于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。 如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒 DNA 线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转 录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。 如果在转录体系中加入 GMP，则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得 RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA？需加入带帽 NTP 类似物即可，本公司提供 5 种供选择。
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文献和实验。） 使用不同的聚合酶 通常用于体外转录的三种 RNA 聚合酶可以相互不同地转录给定的模板。当转录不能完成时，可以充分利用这种转录给定模板序列的不同能力。改变转录模板前面的聚合酶启动子序列是一种劳动密集型修复，因为它可能需要设计 PCR 引物或亚克隆。Ambion 具有可简化过程的载体和引物。pTRIPLEscript 系列载体具有串联排列的 SP6、T7 和 T3 启动子，这些载体特别适用于亚克隆转录模板。或者，Ambion 的无克隆启动子添加试剂盒 Lig'nScribe 可用于改变可 PCR 扩增
利用BLOCK-iT8482; RNAi技术，进行简单、高效的RNAi分析！
(siRNA)可以很容易地、特异地降解互补靶mRNA。 当前常用的用来在哺乳动物细胞中启动RNAi反应的方法包括以下几种：转染合成的siRNA寡核苷酸（siRNA oligonucleocides），体外转录后通过Dicer酶将长的双链RNA（dsRNA）切割成Diced siRNA (d-siRNA)，或者导入能够表达siRNA的载体。在这些方法中，只有体外转录和切割（Dicing）能够形成d-siRNA 双链体的复杂池，继而经过转染进入细胞。这一过程可以很快产生结果，而无需再花费时间设计和检测
的防污染操作。制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。对于原位杂交的应用，为了更好地进行杂交
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