DNA 5’末端标记试剂盒产品及特点: 本产品为DNA5’末端标记系统,利用T4PolynucleotideKinase(T4多聚核苷酸激酶)和[γ-32P]ATP对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5’末端进行高效标记反应。原理如下:
DNA 5’末端标记试剂盒本产品具有下列特点: 1.使用本试剂盒之前,不需要对5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理,因为使用的kinase能使5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。 2.合成的单链或双寡核苷酸的5’末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。 3.提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行,均能得到大于106cpm/pmol(5’-end)的比活性。
DNA 5’末端标记试剂盒运输及保存: 低温运输,-20℃保存,有效期一年。 自备试剂:DNA片段、[γ-32P]ATP或其它的标记、未标记的ATPs、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
DNA 5’末端标记试剂盒使用方法 一、交换反应 1.实验前需自备的试剂:7M醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等 2.在微量离心管中制备下列反应液:
DNA 5’末端标记试剂盒注:5pmoles的5’末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。 3.37℃反应30分钟。 4.70℃加热5~10分钟使酶失活。 5.加入10μL的7MCH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。 6.加入87.5μL(2.5倍)的冷无水乙醇,-20℃放置30~60分钟。 7.离心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。 8.用适当Buffer溶解沉淀。注:通过第5~8步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P]ATP,如要完全将其除去时,乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用抽提除去蛋白质时,请在第8步之后进行。
DNA 5’末端标记试剂盒二、磷酸化反应标记 A.去磷酸化反应 1.实验前需自备的试剂:TE饱和酚/氯仿、3MNaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等 2.在微量离心管中制备下列反应液:
DNA 5’末端标记试剂盒四、合成DNA寡核苷酸的标记当掺入水平很低的时候,需要使用本步骤,即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。SephadexG-50层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs效果很好,它还能大幅减少小于20个碱基的DNA寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5~10分钟以使T4多聚核苷酸激酶失活。SephadexG-25层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。
DNA 5’末端标记试剂盒使用举例 按照使用方法中交换反应和合成DNA寡核苷酸的标记的实验操作,取λ-BstPI,λ-HpaI,λ-EcoT22I各3pmols,用[γ-32P]ATP通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示:
DNA 5’末端标记试剂盒注意事项 1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中,使用前充分混匀。 2.5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现,但不影响反应效果。 3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。 4.当用于交换反应的DNA在5pmoles以上(约1,000bp以上)时,标记效率有时会低于106cpm/pmol。 5.如果交换反应所用DNA低于500bp时,标记效率有时会有所降低。 6.若不进行放射线标记,仅使用本试剂盒做5′末端磷酸化反应时,反应体系中的[γ-32P]ATP可用5μL的10mMATP代替。 7.磷酸化反应时的[γ-32P]ATP可用[γ-35S]ATP替代。