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环氧合酶-2 (COX-2) ELISA 试剂盒

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  • 2025年12月28日
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      广州健仑生物科技有限公司

    环氧合酶-2 (COX-2)简介
    COX是一种膜结合酶,负责花生烯酸氧化生成前列腺素G2(PGG2)以及随后PGG2转变为PHG2。这是各种前列腺素生成的第一步。COX至少有两种不同的亚型,组成表达型COX-1,和诱导型COX-2。COX-1行使着看家功能,如血管止血,肾流血量,肾小球功能维护。COX-2存在于部分细胞内,发出炎症信号,如生长因子,细胞因子和内毒素。
    环氧合酶-2 (COX-2)实验原理
    试剂盒采用夹心酶免法,采用了两种高特异性抗体,TMB作为着色剂,最终溶液所显示的颜色强度与样品中COX-2的量成正比
    检测范围
    1.09~70ng/mL
    环氧合酶-2 (COX-2)预期用途
    1. 试剂盒可用于细胞上清裂解液中人COX-2的检测
    细胞培养液
    1) 将细胞培养液(1x105~1x107个细胞)加入至0.5ml的IBL裂解液中(货号为#19022)
    2) 在振荡器上混匀或用移液枪吹打混匀
    3) 2-8℃下旋转30min使其溶解
    4) 2-8℃,10000rpm下离心10min
    5) 有必要的话用EIA缓冲液稀释上清液
    2. 细胞裂解液试验中,建议所用细胞数应一致
    3. 建议总蛋白浓度也同时检测,可检测到人COX-2与总蛋白的关系
    环氧合酶-2 (COX-2)试剂盒组成
    1. 微孔板,96孔,包被有抗人COX-2鼠IgG单抗
    2. 酶标抗体浓缩液,30X,HRP标记的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml
    3. 标准品,重组人COX-2,0.5mlx2
    4. EIA缓冲液,30ml
    5. 酶标抗体稀释液,内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液,12ml
    6. 显色剂,TMB,15ml
    7. 终止液,1N硫酸,12ml
    8. 洗涤缓冲浓缩液,50ml,40X,0.05%吐温20的磷酸缓冲液
    环氧合酶-2 (COX-2)操作指南
    实验所需器材但试剂盒不提供
    1. 酶标仪(450nm)
    2. 微量移液器和取样吸头
    3. 带刻度的量筒与烧杯
    4. 蒸馏水
    5. 温育器(37℃±1℃)
    6. 冷床箱(4℃)
    7. 坐标纸(log/log)
    8. 吸水纸
    9. 用于稀释标准品的试管
    10. 洗涤瓶
    11. 酶标抗体稀释的一次性试管
    准备
    1. 洗涤缓冲液制备:先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内用完
    2. 标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。
    例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体浓缩+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
    此步骤在实验前完成
    剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
    3. 标准品的制备:吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到140ng/ml的人COX-2标准品
    4. 标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
    每管的浓度如下
    1号管 70 ng/ml
    2号管 35ng/ml
    3号管 17.5ng/ml
    4号管 8.75ng/ml
    5号管 4.38ng/ml
    6号管 2.19ng/ml
    7号管 1.09ng/ml
    8号管 0pg/ml(试验样品空白)
    吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为70~1.09ng/ml
    缓冲液稀释
    实验步骤
    使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行
    试剂
    检测样品
    标准品
    检测样品对照孔
    试剂对照孔
    检测样品100ul
    稀释标准品(1-7管)100ul
    EIA缓冲液(第8管) 100ul
    EIA缓冲液100ul
    盖板,37℃下孵育60min
    洗板7次
    酶标抗体
    100ul
    100ul
    100ul
    -
    盖板,4℃下孵育30min
    洗板9次
    显色剂
    100ul
    100ul
    100ul
    100ul
    室温避光温育30min
    终止液
    100ul
    100ul
    100ul
    100ul
    加终止液后30min内450nm处读取OD值
    1. 确定好空白孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
    2. 确定好样品对照孔,检测样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
    3. 盖板,37℃孵育60min
    4. 用洗瓶洗板,在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒,弃取洗涤液。重复7次,最后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时,用洗板机洗四次后,再用洗瓶洗3次。
    5. 每孔加入100ul酶标抗体。
    6. 盖板,4℃下温育30min
    7. 按照步骤4)洗板9次
    8. 将所需量的显色剂加入到试管中,然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染,请勿将剩余试剂倒入显色剂原装瓶中。
    9. 室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
    10. 每孔中加入100ul终止液,此时溶液颜色会变成黄色。
    11. 除去包被板孔底的杂质或水滴,同时确保液体表面无泡沫, 30min内在450处读取OD值。
    特别注意
    1. 样品采集后应立即检测,如需贮存的,则应放置在冰冻条件下,避免反复冻融,检测前应在低温下将其溶解并完全混合
    2. 如有需要,样品可用EIA缓冲液稀释
    3. 建议试验样品和标准品做双份检测
    4. 试验样品应在中性PH范围内,有机溶剂的污染会影响试验
    5. 只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板,洗板不充足可能会导致试验失败
    6. 彻底倒去洗涤液,吸水纸上拍干,不能用吸水纸擦拭微孔
    7. 底物液应避光保存,因其对光敏感,且要避免接触金属
    8. 加入终止液后30min内读数
    结果计算
    绘制标准曲线前,将所有的检测孔(包括标准品和未知样品)的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上,以标准品的OD值(减去空白后的值)对其相应的浓度,通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。
    典型标准曲线.
    附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果
    注:本译文由健仑生物研究人员翻译仅供参考,详情请以原文为准。

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