Real-Time PCR快速反应液（染料法)

特别提示：包括Real-Time PCR快速反应液（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Real-Time PCR快速反应液（染料法)
英文名称：QuickFire qPCR PreMix（SYBR Green)
产品货号：WH0105
产品规格：125次|500次|5000次

本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂，可对目标DNA进行快速、特异性的定量检测。优化的预混液可缩短Real-Time PCR的反应时间，适用于标准或快速PCR仪。

QuickFire qPCR PreMix采用了抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，配合独特的快速PCR Buffer体系可确保在所有的Real-Time PCR仪上进行灵敏的qPCR反应，具有反应快速、PCR反应时间缩短60%，同时具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点，使你在不影响PCR效果的前提下更快获得结果，节约科研时间和能源。

产品特点：
·zuì快速：QuickFire系列的SYBR Green法产品，采用了可快速激活的抗体修饰Anti Taq DNA聚合酶，配合独特的快速Buffer体系，可节省多达60%的反应时间，成为目前市面上zuì快速的SYBR Green试剂。
·扩增能力强：扩增荧光信号强，结果更准确可信。
·稳定性好：Buffer中添加独特的PCR稳定剂和增强剂，使结果更稳定，重复性好，更准确可信。
·仪器广泛适用：不仅适用于快速荧光定量PCR仪，也适用于普通荧光定量PCR仪。
· ROX校正：单独包装的ROX染料，使用更灵活，结果更准确。

试剂盒原理：
本产品采用了特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶进行快速PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的，适用于标准和快速PCR仪。
1．本产品中特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶，95℃条件下孵育1min即可激活全部酶活，在缩短变性时间的同时避免了非特异性产物的扩增。
2．本产品的快速PCR Buffer体系添加了独特的PCR稳定因子，配合精心优化的快速PCR Buffer体系，可大大缩短变性、退火和延伸时间，使PCR总运行时间缩短60%，更快获得实验结果，而不影响PCR反应效果。
3．本产品针对cDNA模板和gDNA模板结构组成的差异，对PCR的反应步骤进行了特别的优化，使较难扩增的gDNA模板也能获得良好的PCR结果。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次	20μl×5000次
2×QuickFire qPCR PreMix	1.25ml	4×1.25ml	40×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml	10×1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml	50×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的QuickFire qPCR PreMix和ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
2．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
3．引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
4．引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
5．20μl反应体系中，cDNA模板的使用量一般小于100ng，基因组DNA模板量一般小于50 ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

操作步骤：

一、建立Real-Time PCR反应体系：
请注意将QuickFire qPCR PreMix和ROX Reference Dye避光保存。

1．融解QuickFire qPCR PreMix （如果保存在-20℃)，ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下溶解并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。

成分	50μl体系	25μl体系	20μl体系	终浓度
2×QuickFire qPCR PreMix	25μl	12.5μl	10μl	1×
正向引物（10 μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
反向引物（10μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
cDNA模板	-	-	-
50×ROX Reference Dye②	-	-	-	-
RNase-free ddH2O	至50μl	至25μl	至20μl	-

①引物终浓度为300 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在50-900 nM范围内调整。
②几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度见下表：
 ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等：5×（例如5μl ROX/50μl体系)
 ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl体系。
 Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：无需添加。
二、进行Real time PCR反应：
建议采用两步法PCR反应程序进行反应；若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应
两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	1min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	5sec	变性	否
		60℃①	15sec②	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	1min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	5sec	变性	否
		50-60℃③	10sec	退火	否
		72℃	15sec②	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

①请先使用60℃ 15 sec进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在56-66℃范围内进行。
②使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定如下：
 使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast，Roche，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15 sec。
 使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
 使用ABI7500时请设定在32 sec。
③通常引物退火温度比引物的解链温度（Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。

3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

进行RT-qPCR反应时的操作建议：
进行RT-PCR反应时，有三种cDNA第一链合成试剂盒可以选择，分别是QuickQuant RT Kit（with gDNase)（WH0098），Quant cDNA第一链合成试剂盒（WH0097)，和BaiScript cDNA第一链合成试剂盒（KR104)。

引物设计说明：
进行Real-time PCR反应时，PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高，反应特异性强的引物可以参考以下要求。
1．引物长度：18-30个碱基。
2．GC含量：40-60%
3．Tm值：引物软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度也有关。上下游引物的Tm值要尽量接近。简单的Tm计算公式为：Tm = 4℃（G + C)+ 2℃（A + T)。一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。
4．PCR扩增产物长度zuì好在100-150 bp之间。尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。避免上下游引物3"端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。引物3"端碱基不能有多于3个连续的G或C。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。避免引物3"末端碱基为T。引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。

常见问题：

1．无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体

原因	解决办法
DNA模板中存在抑制剂	重新纯化模板或降低模板使用量
Mg2＋浓度不合适	使用QuickFire qPCR PreMix时，PCR反应体系中Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度提高到5 mM。进行Mg2＋终浓度优化时，建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行实验。
加样错误或试剂问题	检查试剂浓度和保存条件，包括所使用的引物和模板。重复进行实验。
PCR条件、引物序列或浓度不当	请确认引物未发生降解，引物浓度及PCR条件，扩增不好时，通常先尝试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好，请重新设计引物。
起始模板问题	检查起始模板的浓度，保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释，并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。

2．NTC出现较高的荧光值

原因	解决办法
试剂污染	建议使用新试剂进行实验。
PCR反应液配制时发生污染	采取必要的防污染策略（如使用带滤芯的枪头)。
引物出现降解	可以使用变性聚*烯酰胺胶检测引物降解情况。

3．出现引物二聚体和（或）非特异扩增

原因	解决办法
Mg2＋浓度不合适	使用QuickFire qPCR PreMix的反应体系含有Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度增加到5 mM。建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行优化。
PCR退火温度太低	建议每次增加2℃进行退火温度优化。
引物设计不合适	考虑重新设计引物序列。
PCR产物太长	荧光定量PCR产物长度zuì好在100-150 bp之间，而且不应该超过500 bp。
引物出现降解	可以使用变性聚*烯酰胺胶检测引物降解情况。
计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

4．定量值重现性差

原因	解决办法
仪器方面的故障	因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
样品纯度不好	不纯的样品会导致实验的重现性差。
稀释的模板放置太久	通过梯度稀释的模板zuì好现配现用。
引物质量下降	尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。
PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当	扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物。
计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

除了Real-Time PCR快速反应液（染料法),，我公司还供应以下相关产品：


BTN130840 硫酸镁溶液(PCR级MgSO4溶液) 5mL
BTN91107 SP6体外转录试剂盒 50次
WE0103 Bes Taq DNA Polymerase 500U|2500U
WE0123 高效热启动DNA聚合酶 500U|2500U
WE0147 一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(荧光探针) 100次
WE0152 快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)(低含量ROX校正染料) 5ml
ALH191 荧光定量反转录PCR试剂盒(两步法) 50μl×25次|50μl×50次
RFT104 M-MLV反转录酶(RNase H-) 2000U
SY0037 即用型PCR预混溶液 1ml
SY0053 胞苷三磷酸溶液(100 mM)(CTP) 1ml
JN0054 PCR增强剂I 0.5ml×5
QN0951 通用RT-PCR试剂盒(M-MLV) 25T|50T|100T
QN0969 2×Pfu PCR MasterMix (含染料) 1ml|5ml
MT0030 LAMP试剂盒(含染料) 50T|200T