O型\A型\Asia1型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测试

O型\A型\Asia1型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测试剂盒
口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的多种偶蹄动物高度接触性传染病。口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，约含8500个核苷酸。目前已知该病毒有7个血清型，分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3，每种血清型包括多个亚型，各型之间无交叉保护。我国及周边国家流行O型、A型和Asia1型3种血清的FMDV，对FMDV进行准确定型和遗传变异分析，是FMD疫苗选择和防控措施制定的重要依据。为此，本公司建立了一种能扩增O型、A型和Asia1型3种血清型FMDV的通用RT-nPCR方法，灵敏度高，特异性强。

O型\A型\Asia1型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测试剂盒产品特点：
1. 通用性强，可用于O型、A型和Asia1型3种血清型FMDV的定性鉴定检测和分子流行病学调查。
2. 能对样品中FMDV进行快速检测，具有良好的特异性和敏感性。
3. 结合扩增产物的克隆测序技术，可对FMDV进行准确分型。
4. 使用一管式RT-PCR试剂盒，减少了操作步骤，降低了操作误差。

O型\A型\Asia1型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测试剂盒产品组成：

组分	编号	规格
双酶一管式RT-PCR Buffer，2×	BTN91202A	750 μL
MMLV-Taq Mix	BTN91202B	100 μL
即用型PCR Mix 3.0	BTN90805	1.5mL
通用FMDV专一性引物对一	yw13151316	100 μL
通用FMDV专一性引物对二	yw13171318	100 μL
通用FMDV阳性对照	yw13191320	50 μL
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

O型\A型\Asia1型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测试剂盒使用方法：

一、样品RNA的制备
用自选方法纯化FMDV样品的RNA，也可以另购本公司的一管式病毒RAN提取试剂盒(BTN3073)或柱式病毒RNA(BTN71001)提取试剂盒，上述两款产品跟本试剂盒兼容。

二、阳性对照
1. 为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 使用本阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。最好在专门的区域操作。

三、设置RT-nPCR反应
(一) 第一次RT-PCR：
3. 在PCR管中加入下列成分(30μl体系)：

成 份	样品	阳性对照	阴性对照
双酶一管式RT-PCR Buffer，2×	15μl	15μl	15μl
通用FMDV专一性引物对一	2μl	2μl	2μl
样品RNA	1-5μl	无	无
通用FMDV阳性对照	无	2μl	无
补超纯水到	28μl	28μl	28μl
MMLV-Taq Mix	2μl	2μl	2μl

4. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行RT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	60℃	30分钟
预变性	95℃	5分钟
PCR反应 (30个循环)	94℃	30s
	58℃	40s
	72℃	1分钟
延伸	72℃	5分钟

5. 电泳检测RT-PCR产物。预期的PCR产物长度为1187 bp。
(二) 第二次PCR：
6. 在PCR管中加入下列成分(25μl体系)：

成 份	样品	阳性对照	阴性对照
通用FMDV专一性引物对二	2μl	2μl	2μl
第一次RT-PCR产物	1-2uL	无	无
通用FMDV阳性对照	无	2μl	无
补超纯水到	12.5μl	12.5μl	12.5uL
即用型PCR Mix 3.0	12.5uL	12.5uL	12.5uL

7. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	3分钟
PCR反应 (30个循环)	94℃	30s
	58℃	40s
	65℃	1分钟
延伸	65℃	5分钟

8. 电泳检测PCR产物。预期的PCR产物长度为996bp。