铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌双重荧光PCR检测试剂盒

铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌双重荧光PCR检测试剂盒
一、简介：
本试剂盒采用TaqMan 荧光探针技术，对铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌中的特异性核酸序列进行扩增并检测，从而判断铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌的存在。铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌基因序列设计引物及荧光探针，通过荧光PCR 仪进行扩增检测，从而实现对铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌的检测。
本试剂盒可在一个反应体系中同时检测和区分铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌基因，其中肺炎克雷伯菌(Klebsie lla pneumoniae，KP)基因的探针报告基团为FAM，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aernginosa，PA)
基因的探针报告基团为ROX。

二、铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌双重荧光PCR检测试剂盒用途：
该试剂盒适合于检测水样粪便、疑似污染物的水、食物等样本中的铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌，用于铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌反应液(PA/KP qPCR MIX) 1管 672μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌阳性对照(PA/KP-PTC) 1管 50μL/管

四、铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌双重荧光PCR检测试剂盒储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列、MJ系列、Roche系列，博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。

六、样品采集与DNA 提取
6.1 样品的采集
6.1.1 食品样品：样品的采集与预培养按照样相关标准要求进行。
6.1.2 粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
6.1.3 病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
6.2 DNA提取
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
对上述处理好的样本加入等体积核酸提取液(固体标本加入50μL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌双重荧光PCR检测试剂盒检测步骤：
7.1 试剂准备
从试剂盒中取出荧光PCR 反应液(qPCR MIX)、酶混合液(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm 离心10s。
设所需要的PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合液 1µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR 反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(PA/KP-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM和ROX。其中FAM 基团检测KP，ROX基团检测PA。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
(1)阴性对照(NTC)：FAM和ROX通道全部阴性。
(2)阳性对照(PA/KP-PTC)：FAM和ROX通道均有扩增曲线。
(3)以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1)FAM通道：Ct值≤35 KP核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明KP核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明KP核酸阳性；否则判为样本阴性。
(2)ROX通道：Ct值≤35 PA核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明PA核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明PA核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2)所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA 酶。
(3)PCR 操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR 扩增区等)，防止实验室污染。
(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。