PicaGreen（PicoGreen）

试剂组成：

 

操作步骤：

1、试剂制备

PicaGreen dsDNA （Component A ）(定量试剂是以1mL 的浓缩液形式保存在无水的DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制2XPicoGreen 试剂的操作溶液，用1xTE（Component B）按1:200 的比例稀释浓缩液。如果要准备足够的操作溶液测定20 个样品，可在20mL1x TE （Component B）中加入100μLPicaGreen dsDNA（Component A ） 定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicaGreen 试剂（Component A ）见光易降解，所以应将配好的溶液用锡箔包住或放置暗处避光保存。溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。

 

2、 DNA 标准曲线 

2.1 预备1μg/mLdsDNA（ Component c） 或贮存液于1x TE 中。根据在1cm 光程长度的比色杯中A260nm 时的吸光度确定DNA 浓度；相应于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。尽管任何纯化的dsDNA 制剂都可用来做标准曲线，但常用的是小牛胸腺DNA。最好用跟被检测的样品相似的DNA 做标准曲线，用或长或短的线型DNA 片段测定相近大小的酶切片段；质粒用于测定质粒DNA。然而大部分线状dsDNA 分子，不管其片段长度大小，都会产生大致相等的信号。PicaGreen 试剂测定法在通常污染核酸制剂的几种复合物存在的条件下仍能保持线状，尽管信号强度可能受到影响。因此，为了得到有效的对照处理，被用

来做标准曲线的dsDNA 溶液要用和实验样品相同的方式来处理，并且应该包含相同的可能存在的污染物。 

2.2 要产生从0.5ng/mL 到500ng/mL（见表1）单重复8 个点的标准曲线，在2X 终浓度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同体积的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，放入10×10mm 比色杯中。混合相同体积的1XTE 和2XPicaGreen 操作溶液以备空白对照。避光于室温下放置2-5 分钟。

 

2XDNA 溶液浓度 （ng/mL）	2XDNA 溶液的体积 （mL）	2XPicaGreen   溶液的 体积（mL）	PicaGreen   试剂测定中DNA 的终浓度(ng/mL)
1000	1	1	500
200	1	1	100
50	1	1	25
20	1	1	10
5	1	1	2.5
2	1	1	1
1	1	1	0.5
0	1	1	空白

 

表1 用10×10mm 比色杯时DNA 标准曲线

 

2.3 当用微量检测皿适配器时，PicaGreen 测定也可在较低的测定体积（50μL 到200μL）内完成。欲产生从1ng/mL 到100ng/mL（见表2）的标准曲线，在2X 终浓度下配制一系列的DNA 溶液，混合相同体积的2XDNA 和2XPicaGreen 操作溶液，将至少50μL 溶液转移到微量检测皿中。确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部经常可以驱散气泡。避光于室温下放置2-5 分钟。

 

2X DNA 溶液浓度 （ng/mL）	2X DNA 溶液的体积 （uL）	2X PicaGreen   溶液的体积（uL）	PicaGreen   试剂测定中DNA 的终浓度(ng/mL)
200	30	30	100
50	30	30	25
20	30	30	10
5	30	30	2.5
2	30	30	1
0	30	30	空白

表2 用微量检测皿时DNA 标准曲线

 

2.4孵育后用合适的荧光计测量样品荧光值。选择蓝色激发光，用荧光值最大的样品校正仪

器。

 

2.5 测量剩余样品的荧光值。不同的微型荧光计将给出一个直接的浓度读数，数据可以用来产生DNA 浓度的标准曲线，下面以TBS-380 微型荧光计为例。

 图1     PicaGreen 标准曲线

3、样品分析

3.1 用1X TE 稀释未知DNA 样品至需要的体积（10×10mm 比色杯需1.0mL，微量检测皿需25-100μL）。对样品高度稀释可以确保任何污染物都被最大限度地冲淡。然而，也要避免取样体积太小而无法精确吸取的情况。去除样品中RNA 和ssDNA 参照4 部分。

3.2 在每个样品中加入2XPicaGreen 试剂的操作溶液（3.1 节准备），混合好，将混合物移入合适的比色杯，避光于室温下放置2-5 分钟。

3.3 可以对样品进行不同的稀释处理重复测定以确保结果的准确性。

 

4 去除样品中单链核苷酸

当ssDNA 与dsDNA 等摩尔浓度时，后者的测定受前者的干扰很小。前者浓度10 倍于后者时，。对荧光信号的干扰也不过10%。但当DNA 浓度低时，ssDNA 能产生较大干扰在高浓度时，由RNA 结合PicaGreen 试剂产生的荧光值用RNA酶处理样品可消除。RNA 酶A、酶T1 结合核酸酶S1 能除去所有单链核酸，从而保证样品荧光值是由dsDNA 产生。（具体做法请查阅相关的参考文献）

 

参考文献：

[1] Nucleic Acids Res. 24, 2623 (1996)

[2] BioTechniques 21, 372 (1996)

[3] BioTechniques 21, 664 (1996)

[4] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6091 (1996)

[5] Anal. Biochem. 102, 344 (1980)

[6] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and

T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,  New York (1989)