Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

特别提示：包括Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
英文名称：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
产品货号：WE0325
产品规格：50次

  本试剂盒是一种采用Annexin V-FITC与PI双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。
  细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。另外一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)不能通过完整的活细胞，但能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色， 因此通常将Annexin V与PI配合染色， 以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。

试剂盒组成：

组份	50次
4×Binding Buffer	10ml
Propidium Iodide，PI	500μl
Annexin V-FITC	250μl

注意事项：
1、本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
2、需自备PBS和去离子水。
3、荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
4、PI对人体有刺激性，请注意适当防护。
5、请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤：
1、细胞样品的准备：

a．对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

b．对于悬浮细胞：1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

2、用去离子水按 1:3 稀释Binding Buffer(4ml Binding Buffer +12ml 去离子水)。
3、用 250μl Binding Buffer重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/ml。
4、取 100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V/FITC 和 10μl 20μg/ml的PI溶液。
5、混匀后于室温避光孵育 15 分钟。
6、在反应管中加 400μl PBS，流式细胞仪(FACS)分析。

实验图例


储存条件：2～8℃，避光保存

除了Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：MTS细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒
货号：BTN140634
规格：500次
MTS是一种新型甲臜化合物，和MTT同属四唑氮衍生物。MTS能被活细胞里的线粒体脱氢酶降解而产生棕黄色水溶性的甲臜，通过测定甲臜的光谱吸收，进而可以测定细胞的增殖情况。原理如下：


产品特点：
1．本试剂盒是单溶液式细胞增殖与细胞毒性检测试剂，主要成分包含MTS和一个电子耦合试剂，溶液的稳定性强，反应的灵敏度高。
2．操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时，无需洗涤或收获细胞，免去溶解步骤。
3．无放射性。不需要配制液闪混合物，也不需要处理废弃物。
4．与MTT相比，使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲臜产物。
5．操作灵活，与MTT不同，平板读数后可放回温箱继续孵育，使颜色进一步生成。

储存条件：低温运输，-20℃避光保存，有效期半年。

使用效果：
96孔板中加入细胞100μL/孔(约1×104)，37℃，5% CO2细胞培养箱培养24小时，加入适当浓度的受试化合物。培养箱中孵育适当时间，每孔中加入10μL的MTS细胞增殖及毒性检测溶液。37℃孵育1-4小时。490nm波长检测光密度。

备忘录：
1．细胞的存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加MTS细胞增殖及毒性检测溶液，无细胞)或空白药物孔OD值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTS细胞增殖及毒性检测溶液，无细胞)，各重复孔的OD值取均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。
细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100
2．求出T/C = 50%时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

名称：Annexin V-EGFP/PI双染 细胞凋亡检测试剂盒
货号：SNM529
规格：50T|20T|10T

名称：TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(显色法，细胞样本)
货号：SNM535
规格：50T|20T

名称：Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒
货号：KFS188
规格：10T|20T|50T|100T
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素PE 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD 的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA 的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD 标记DNA 的强弱，将细胞分为三群：7-AAD 强为死亡细胞，7-AAD 弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD 同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI 窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品，可与Annexin V-PE 联合使用。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

注意事项
1. 微量试剂取用前请离心集液。
2. Annexin V-PE/7-AAD 避光保存及使用。
3. 7-AAD 为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不推荐用于检测组织样本。
5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。
6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

名称：DCFH-DA活性氧ROS荧光探针
货号：QN1289
规格：25mg|100mg
别名：二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯
CAS号：4091-99-0

名称：噻唑蓝MTT
货号：QN1307
规格：250mg|1g
本品常用于生化研究中酶活力的测定，也可用于细胞增殖检测。

CAS号：298-93-1
分子式：C18H16N5SBr
分子量：414.3
纯度：≥98%
性状：黄色粉末
溶解性：溶于*醇和DMSO，微溶于水
储存条件：2～8℃避光

名称：JC-1线粒体膜电位检测试剂盒
货号：HR0413
规格：20T/50T/100T
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，488nm 激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，488nm 激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中所有细胞FL1均为阳性。凋亡细胞则大多为FL1 单阳性。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。试剂盒染料与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123 相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别；

储存条件：JC-1-20℃避光保存，避免反复冻融。孵育缓冲液2-8℃保存。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ●离心机 ● 流式细胞仪或荧光显微镜

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● JC-1在温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
●细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 配制染色工作液时，JC-1容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。若仍有不溶的颗粒，可在13000×g离心1分钟，吸取离心后的上清使用。
● 始终保持平衡染液中pH 值的一致性，因为pH 值的变化将影响膜电位。
● 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
● JC-1液产生沉淀离心取上清使用即可，不影响结果。
● JC-1染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
悬浮细胞
1．孵育缓冲液和JC-1染色工作液的配制：根据样品数按下列比例配制孵育缓冲液和JC-1染色工作液。取100μl 10×孵育缓冲液加900μl 无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×孵育缓冲液；在500μl 1×孵育缓冲液中加入5μl JC-1，涡旋混匀配成JC-1染色工作液；
2．收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5×105个。
3．用PBS 洗涤细胞两次。离心收集细胞。
4．用500μl JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。
5．常温离心收集细胞。
6．用500μl 预热的孵育缓冲液将细胞重悬。
7．用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。
贴壁细胞
对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
纯化线粒体
1．把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5倍。
2．0.9mL 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100μg的纯化的线粒体。
3．结果检测。
组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FL1 通道检测；红色荧光通过FL2通道检测。FL-1+,FL-2+为正常细胞，FL-1+,FL-2-为凋亡细胞。
用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如PI或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm 范围内设置激发波长。
阳性对照的设置
一般不需要设置，如果要制备阳性对照细胞，可以用去极化药物羰基*化物间*苯腙CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照，按以下方法操作：CCCP加入到细胞培养液中，终浓度10μM，处理细胞20分钟。随后进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP 处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。