GL6-miR报告基因质粒

特别提示：包括GL6-miR报告基因质粒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：GL6-miR报告基因质粒
英文名称：pGL6-miR Reporter gene plasmid
产品货号：YT444
产品规格：1μg

pGL6-miR报告基因质粒是一种用于microRNA(miRNA)等研究的萤光素酶报告基因质粒。该质粒可用于把目的基因的3’非翻译区(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它适当序列插入到其多克隆位点，然后在哺乳动物细胞中高灵敏度地检测特定microRNA(miRNA)或其它非编码RNA等对该基因3’-UTR或其它靶序列调控活性的报告基因质粒。

pGL6-miR以pGL6质粒为模板，具有氨苄青霉素抗性，并在萤火虫萤光素酶基因之后添加了多克隆位点，便于插入目的基因的3’-UTR或其它适当的靶序列。

pGL6-miR的主要工作原理是，把目的基因的3’非翻译区(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它适当序列插入到萤光素酶基因(luc2)的下游，转染细胞并检测萤光素酶的表达。如果细胞内源或外源表达的miRNA与靶序列结合，通常会抑制萤光素酶的翻译或促进mRNA的降解，从而使萤光素酶的表达量减少。因此通过本报告基因质粒检测萤光素酶的表达水平，可以检测内源或外源表达的miRNA是否对插入的靶序列有调控作用。并且可以通过靶序列中预测的miRNA结合位点的突变，用于比较突变前后萤光素酶表达水平的变化。如果预测的miRNA位点突变后，miRNA的调控作用消失，则基本上说明突变的位点就是miRNA在靶序列中具体的结合位点。

pGL6-miR带有中低等强度的PGK启动子，有利于检测miRNA等对于萤火虫萤光素酶表达水平的下调作用，即当miRNA的抑制作用较弱时也能检测到。并且PGK启动子可以在人、大鼠、小鼠甚至酵母细胞中都可以发挥作用。

pGL6-miR质粒的主要信息如下：

Base pairs	6097bp
Feature Nucleotide	Position
PGK promoter	20-538
luc2 reporter gene	549-2202
Multiple cloning region	2208-2261
SV40 late poly（A） sinal	2268-2512
SV40 early enhancer/promoter	2554-2972
Synthetic neomycin phosphotransferase(Neor)coding region	2998-3792
Synthetic poly(A) signal	3817-3865
Synthetic Beta-lactamase(Ampr) coding region	4980-5840
Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site	5945-6097

pGL6-miR质粒的图谱如下：


使用说明：
1. 首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2. 插入靶序列：在pGL6-miR多克隆位点选取适当的酶切位点，经酶切处理后连入目的基因的3’-UTR或其它适当的靶序列。
3. 以此质粒为模板构建的质粒可以用常规的细胞转染方法转染细胞。检测时可以采用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(YT271)或双萤光素酶报告基因检测试剂盒（YT273）。

储存条件：-20℃。

除了GL6-miR报告基因质粒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：大肠杆菌HB101化学感受态细胞
货号：BTN81221
规格：0.1mL*10
 HB101菌株是E.coli K12菌株与E.coli B菌株的杂合产物(同时也是Stbl3的原始菌株)。recA13突变可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；但不含核酸酶endA1突变，体内核酸酶含量较高，提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液。hsdS20 背景使HB101缺失内切酶系统，增强了外源DNA的稳定性和提取质量。本产品是采用大肠杆菌HB101特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。

产品特点：
1. 具有链霉素抗性。
2.基因型：F- mcrB mrr hsdS20(rB- mB-)recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1galK2 xyl-5 mtl-1rpsL20((strR)glnV44λ-。
3. 不存在 lacIqZΔM15，不可用于蓝、白斑筛选。
4. 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞处于冰水混合状态时，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μL感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴25分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟，晃动会降低转化效率。
4. 每个离心管中加入450μL 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，200rpm 振荡培养60分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃倒置培养12-16小时。

注意事项：
1. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
2. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300μL转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(5000rpm，1分钟)收菌后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
3. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
4. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。