HIS-tag亲和纯化树脂

【产品介绍】
His-Binding-Resin 纯化树脂系采用进口填料分装而成，性质稳定、重复性好、使用简单、方便。胶粒平均直径100微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20 mg/ml（30 kDa）。可以满足大多数实验室级别小量纯化His-tag融合蛋白以及His-Pull-down实验所需。
【使用说明】
1.
离心收集500 ml表达目标蛋白的大肠杆菌培养物，冻融或超声破菌于20 ml破菌缓冲液中。破菌缓冲液: 20-50 mM Tris-HCl，pH 7.3-8.3，含0.25 M-0.5M NaCl，其它常用缓冲液为PBS/TBS。这一步可以适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂，但是不能使用EDTA。还原剂请使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因为DTT会造成Ni/Co离子还原。
2.
离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱（10倍柱体积破菌缓冲液平衡），通常自然流速可以很好结合。少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。流速和硅胶管垂直液面高度成正比，需要高流速时，增加硅胶管长度即可。
3.
样品上样完成以后，使用含有1 mM咪唑的破菌缓冲液洗柱10个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品冲洗干净。
4.
使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，如果杂蛋白太多可以加大洗涤缓冲体积。洗杂缓冲液：破菌缓冲液中补加咪唑到终浓度20 mM。咪唑可以使用上样缓冲液配制成500 mM母液，用前加入。部分蛋白在20 mM咪唑溶液中可能被洗脱，在对未知特性的His-tag融合蛋白做第一次纯化时，需要留样检测。如果大量目标蛋白在这一步中被洗脱，可以先用含有5 mM 咪唑的洗杂缓冲液充分洗柱，然后梯度洗脱目标蛋白，分步收集不同组分并电泳检测。
5.
洗杂结束以后，流出液吸光度OD280应当小于0.02，此时使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。洗脱缓冲液：上样缓冲液中补加咪唑到终浓度200 mM。对于特殊蛋白，还可以选择EDTA洗脱，或者pH梯度洗脱。
6.
收集完成以后，使用10倍柱体积1% 醋酸冲洗纯化柱，再使用PBS/TBS平衡pH，大量纯水洗柱，最后加入5 ml 20%乙醇，封闭上下两端保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻结或干裂。
7.
目标蛋白获得以后，需要及时使用悦克生物蛋白超滤管进行浓缩，切换到适当的缓冲液中保存。