植物线粒体纯化试剂盒

特别提示：包括植物线粒体纯化试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：植物线粒体纯化试剂盒
英文名称：Plant Mitochondria Purification Kit
产品货号：BTN111208
产品规格：5次

植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒。

产品特点：
1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2. 提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析，也可以用于PCR 级别的线粒体DNA和RNA提取。
3. 精提利用冷冻超速离心（离心力达40000g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。
4. 本产品足够5 次提取，每次可处理10g 绿色植物组织（可得1-2.5 mg左右线粒体）或20g非绿色植物组织（可得2-5 mg左右的线粒体）。

产品组成：

组分	编号	规格
匀浆液	BTN111208A	250mL
洗涤液	BTN11208B	250mL×2
离心介质溶液	BTN11208C	150mL
Percoll	17-0891-09	50mL
BSA干粉	048-46-8	10g
带柄尼龙筛		1只
软毛笔		1只

保存条件：常温，有效期一年。

自备试剂：超纯水，可能需要5MKOH调pH，如果需要去除细胞核DNA，还需要自备25mMMgCl2溶液、0.5MEDTA溶液、DNase干粉和另购更多洗涤液。

使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

一：选择组织
1. 植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：

植物组织种类	线粒体产率	说明
根和块茎	0.3mg/10g	如土豆，红薯等
黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘）	2-5mg/10g	多酚含量低于叶片
光合作用的叶片和子叶	1-2.5mg/10g	需放置在暗处3天

2. 一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3 天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3. 一次实验需要40mL 匀浆液、约90mL 洗涤液和35mL 密度梯度离心介质（配制方式是一次性将9.8g (8.7mL) Percoll 加入到26.3mL 离心介质溶液中，充分混匀后得到35mL 密度梯度离心介质）。这三种溶液用前均需要加入BSA 干粉使其终浓度为0.1%（100mL 溶液加0.1g BSA 干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA 干粉加入，否则容易长菌。

二：线粒体粗提操作流程
1. 将10 g的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或20 g 干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL 匀浆液（需先加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。
2. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring 匀浆器中，中速匀浆3 次，每次15 秒，每次之间间隔10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3-4分钟。
  注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH 试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5 M KOH 将pH 调到7.0 以上才进入下一步。
3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4. 在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000 g 离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL 塑料离心管中。
5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12,000 g 离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
6. 加入10mL 预冷的洗涤液（需先加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7. 将线粒体重悬液转移到新的50mL 离心管中，再加入30mL 预冷的洗涤液（终体积为40mL）中，4℃ 1000 g 离心5分钟。线粒体将在上清中。
8. 将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中，4℃ 12000 g 离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15-30%。
9. 在沉淀中加入2mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4 管线粒体沉淀重悬在2mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45-75%。
10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体， *醛酸循环体,或细菌）污染，但可直接用于PCR 级线粒体DNA和RNA的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的自备DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

三：细胞核DNA的去除（纯化测序级的线粒体DNA 才需要进行此操作。本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
11. 预留50uL 线粒体粗提液做对照，在约2mL 剩余的线粒体粗提液中加入40μl25mM的MgCl2，再加入200ug DNase 干粉或溶液（总量为200ug 即可），混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品（如50uL）在PCR 仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase，再取其中的10uL和10uL 预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR，如果DNase 处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA 去除比较干净（达到PCR 检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR 检测不到细胞核DNA。
12. 加入0.32mL 预冷的自备0.5M的EDTA 溶液和40mL 预冷的洗涤液。
13. 4℃ 1000 g 离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中，4℃ 12000g 离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL 洗涤液中。

四：线粒体精提操作方案（需要40000g的超速冷冻离心机）
14. 在50mL 预冷的塑料离心管中先后加入35mL 预冷的密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加0.1% BSA）。
15. 将2mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16. 在超速水平离心机上4℃ 40,000 g 离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：

17. 用广口吸管（可将1mL 蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18. 在15-20分钟的时间内缓慢加入至少4 倍体积的预冷的洗涤液。
19. 转入50mL 塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20分钟，沉淀为线粒体。
20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4 倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在5-15%。
21. 将精提的线粒体重悬在1mL 预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置5-6 小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

五：线粒体后续处理（本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
22. DNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的SDS-蛋白酶K 酶解，酚*仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。也可以用细菌DNA 提取的试剂盒制备DNA。
23. RNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的Trizol 方法制备线粒体RNA。
24. 总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25. 线粒体内膜，外膜、基质纯化：请自备方法。
26. 其他功能检测：请自备方法。

除了植物线粒体纯化试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：


BTN100601 细胞核微量制备试剂盒 50次
BTN120308 植物叶绿体纯化试剂盒 15次
HR0255 叶绿体提取试剂盒 50T/100T
HR0237 组织线粒体提取试剂盒 50T/100T
HR0257 酵母线粒体提取试剂盒 50T/100T
HR8193 微藻细胞核提取试剂盒 50T/100T
HR8194 植物原生质体制备试剂盒 50T/100T
HR8195 酵母原生质体制备试剂盒 50T/100T
HR8201 酵母核糖体提取试剂盒 50T/100T
HR8206 外泌体提取试剂盒(尿液) 50T/100T
HR8207 外泌体提取试剂盒(体液) 50T/100T
HR8208 外泌体提取试剂盒(乳汁/唾液) 50T/100T
HR8209 植物核糖体提取试剂盒(非酶法) 50T/100T
HR8210 植物核糖体提取试剂盒(酶法) 50T/100T
HR8222 高纯度外泌体快速提取试剂盒(细胞培养上清) 20T/50T
HR8223 高纯度外泌体快速提取试剂盒(血清/血浆) 20T/50T
BTN111208 植物线粒体纯化试剂盒 5次
GL2490 叶绿素提取液 500ml
GL2491 叶绿体分离试剂盒 50T|100T
GL0235 细胞线粒体分离试剂盒 50T
GL0236 组织线粒体分离试剂盒 50T