MTT细胞增值与毒性检测试剂盒

特别提示：包括MTT细胞增值与毒性检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：MTT细胞增值与毒性检测试剂盒
英文名称：MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit
产品货号：QN1308
产品规格：500T

MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan，在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解，然后通过酶标仪可以测定490nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高;细胞毒性越大，则吸光度越低。

使用说明：
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μL，3000-10000个细胞/孔。
2.置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3.加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。
4.小心吸去上清，加入90μL新鲜培养液，再加入10μL MTT溶液，继续培养4 h。
5.然后吸掉上清，每孔加入110μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
6.同时设置调零孔(培养基、MTT、 Formazan溶解液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、 Formazan溶解液)，每组设定3复孔。

注意事项：
1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液;另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2.MTT溶液为黄色需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

储存条件：-20℃

除了MTT细胞增值与毒性检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：细胞凋亡与坏死检测试剂盒
货号：YT130
规格：100次
本试剂盒提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡与细胞坏死检测方法。染色快速方便，两种染料的染色仅需20-30分钟，一步染色即可完成。使用方便，使用流式细胞仪检测时，无需稀释等配制过程，也无需再准备其它任何溶液。本试剂盒足够检测100个样品，每个样品的细胞数量可以为10-100万。

试剂盒组份：
细胞染色缓冲液———100ml
Hoechst染色液———0.5ml
PI染色液——————0.5ml

本试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。
Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。参考下图，左图为诱导凋亡前的正常细胞，右图为诱导凋亡后的细胞。



注意事项：
1. 需使用流式细胞仪进行红色和蓝色双荧光检测。也可使用荧光显微镜检测。
2. 染色后宜尽快检测。
3. Hoechst 33342对人体有害，碘化丙啶(PI)对人体有刺激性，请注意适当防护。

储存条件：-20℃避光，有效期一年。

名称：Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒
货号：KFS208
规格：100T|50T
凋亡早期的重要特征之一是半胱氨酸特异性蛋白酶——caspase家族蛋白的活性激活。这一类酶可以参与到一系列的生化反应中，响应凋亡早期信号并导致相应的蛋白底物剪切，继而引发细胞解体。目的底物可识别的序列包含天门冬氨酸残基，剪切发生在序列的羰基段。

Caspase3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒采用新型的荧光底物为原料，可以检测凋亡细胞中激活的caspase3/7.这种具有膜亲和型的检测试剂盒由一个4氨基的小肽（DEVD）和一种核酸结合染料。凋亡发生时，caspase3/7蛋白被激活，从而剪切caspase3/7识别序列DEVD肽段。剪切底物后，游离的核酸染料与DNA结合，从而发出亮绿色荧光信号。

操作步骤
1.1 以合适的培养基悬浮细胞或贴壁细胞，加入合适的化合物或药物，刺激细胞诱导凋亡。
1.2 去除药物或化合物，以新鲜培养基洗涤细胞2-3次，更换新鲜培养基后，以1μL/mL的量加入caspase3/7检测液，使得caspase3/7检测试剂工作液浓度为1μM。（注意： Caspase3/7 检测试剂工作液浓度为0.5μM~2μM，您根据细胞量以及培养液的体积进行调整优化。）
1.3 37℃，避光孵育30min，或室温孵育45-60min。
1.4 荧光显微镜观察拍照或荧光光度计读数。

名称：噻唑蓝MTT
货号：QN1307
规格：250mg|1g
本品常用于生化研究中酶活力的测定，也可用于细胞增殖检测。

CAS号：298-93-1
分子式：C18H16N5SBr
分子量：414.3
纯度：≥98%
性状：黄色粉末
溶解性：溶于*醇和DMSO，微溶于水
储存条件：2～8℃避光

名称：JC-1线粒体膜电位检测试剂盒
货号：HR0413
规格：20T/50T/100T
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，488nm 激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，488nm 激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中所有细胞FL1均为阳性。凋亡细胞则大多为FL1 单阳性。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。试剂盒染料与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123 相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别；

储存条件：JC-1-20℃避光保存，避免反复冻融。孵育缓冲液2-8℃保存。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ●离心机 ● 流式细胞仪或荧光显微镜

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● JC-1在温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
●细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 配制染色工作液时，JC-1容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。若仍有不溶的颗粒，可在13000×g离心1分钟，吸取离心后的上清使用。
● 始终保持平衡染液中pH 值的一致性，因为pH 值的变化将影响膜电位。
● 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
● JC-1液产生沉淀离心取上清使用即可，不影响结果。
● JC-1染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
悬浮细胞
1．孵育缓冲液和JC-1染色工作液的配制：根据样品数按下列比例配制孵育缓冲液和JC-1染色工作液。取100μl 10×孵育缓冲液加900μl 无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×孵育缓冲液；在500μl 1×孵育缓冲液中加入5μl JC-1，涡旋混匀配成JC-1染色工作液；
2．收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5×105个。
3．用PBS 洗涤细胞两次。离心收集细胞。
4．用500μl JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。
5．常温离心收集细胞。
6．用500μl 预热的孵育缓冲液将细胞重悬。
7．用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。
贴壁细胞
对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
纯化线粒体
1．把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5倍。
2．0.9mL 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100μg的纯化的线粒体。
3．结果检测。
组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FL1 通道检测；红色荧光通过FL2通道检测。FL-1+,FL-2+为正常细胞，FL-1+,FL-2-为凋亡细胞。
用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如PI或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm 范围内设置激发波长。
阳性对照的设置
一般不需要设置，如果要制备阳性对照细胞，可以用去极化药物羰基*化物间*苯腙CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照，按以下方法操作：CCCP加入到细胞培养液中，终浓度10μM，处理细胞20分钟。随后进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP 处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。