Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)

产品简介：
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100， 低浓度sodium pyrophosphate等组成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制剂，并维持原有的蛋白间相互作用。
用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)

操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
按照6孔板每孔加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
10000～12000g，离心3～5min(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、 取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。通常6孔板每孔细胞加入100μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150～200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、 10000～12000g，4℃离心3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。
(三)组织样本
1、 取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，根据实验需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越。
3、 取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
4、 按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。
5、 步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例加入Western及IP细胞裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
6、 按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。
7、 10000～12000g，4℃离心10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
8、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
 
Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)

注意事项：
去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
溶解Leagene Cell lysis buffer for Western and IP时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。