细胞膜电位检测试剂盒

特别提示：包括细胞膜电位检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞膜电位检测试剂盒
产品货号：HR8271
产品规格：50T/100T

细胞荧光探针系列D43 是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，它本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。D43荧光探针进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化;反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。D43不受线粒体膜电位影响，使其能特异性的用于测量细胞膜电位变化。D43 最大吸收波长490nm，最大发射波长516nm。

储存条件：膜电位探针 -20℃避光保存，避免反复冻融。检测缓冲液2-8℃保存。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ●离心机
● 流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦、酶标仪、荧光分光光度计等有488-493nm激发波长的检测仪器，检测波长516-525nm。

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● D43探针在冬天温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 始终保持平衡染液中pH 值的一致性，因为pH 值的变化将影响膜电位。
● 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
●染色液产生沉淀离心取上清使用即可，不影响结果。
● D43染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
● D43染色探针不可以一次性全部配好，应根据每次细胞数量现配现用，长期不用的可以分装后用铝箔纸包好-20℃冻存。避免反复冻融。
以下以活细胞为例，实验步骤仅做参考，具体最佳细胞数量，最佳染色时间，因细胞不同而不同，根据实际情况调整。
细胞准备：
贴壁细胞：96孔板，细胞数量约40000-80000/孔，100μl培养基，培养过夜。
悬浮细胞：96孔板，细胞数量约125000-250000/孔，100μl培养基，培养过夜。
组织样本：
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。
染色工作液准备：
1．1×检测缓冲液配制：根据样品数按下列比例配制1×缓冲液。
取100μl 10×检测缓冲液加900μl无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×检测缓冲液；
2．染色工作液的配制
D43室温或水浴融解，在500μl 1×检测缓冲液中加入5μl D43细胞膜电位探针，充分混匀配成D43染色工作液；
染色：
1．如果是培养板原位检测，移除培养基，用PBS 洗细胞一次，加入100μl染色工作液。
2．如果流式检测，收集样本细胞，细胞数量在2-5×105个。用PBS 洗涤细胞两次。离心收集细胞。然后用500μlD43染色工作液将细胞重悬。
3．加入染色工作液的细胞在培养箱中或者室温孵育30分钟-1小时。
4．用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

结果分析：
检测时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为525nm；
用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。
或者用流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：激发波长为488nm，发射波长为525nm。如果激发波长不能设置为488nm时，可以在488-493nm 范围内设置激发波长。

除了细胞膜电位检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：XTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒
货号：BTN140635
规格：500次
XTT能被活细胞里的线粒体脱氢酶降解而产生橙黄色水溶性的甲臜，通过测定甲臜的光谱吸收，进而可以测定细胞的增殖情况。XTT与MTT同属四唑氮衍生物，它们检测细胞活性的反应原理相似，原理图如下：


产品特点：
1．盒灵敏度，可检测低细胞密度样品，检测结果的重复性优于MTT。
2．操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时，无需洗涤或收获细胞，免去溶解步骤。
3．无放射性。不需要配制液闪混合物，也不需要处理废弃物。
4．与MTT相比，使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲基产物。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	5ml
溶液B	50ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存)，有效期一年。

使用方法：
下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。

㈠、接种细胞
1．按常规胰酶消化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。
2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。
3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。
4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10?个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10?个/mL。
5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。
6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。
 注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。
7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11列反应的影响。
8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。

㈡、药物处理
9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。
13．按常规方法把96孔板继续放在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。
14．处理结束后去除第2到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。
15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。

㈢、存活细胞计数
16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。
 注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。
17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，最好尽可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。
19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。
 注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。
20．计数同样处理的各次重复的平均值。
21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。
 注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。