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- 2025年07月13日
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- 文献和实验
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-20℃&-80℃
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3个月~12个月
- 英文名：
pESC-TRP质粒
- 库存：
41
- 供应商：
上海禾午生物科技有限公司
- 规格：
2ug冻干粉&300ul甘油菌
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文献和实验相关专题 完美酵母质粒提取实验Protocol 问：请教如何从酿酒酵母抽提质粒 ? 用胞壁松解酶处理以后，再用SDS处理，是否就可以破碎酵母了，因为是抽提质粒，不是抽基因组 DNA，可以不用蛋白酶K处理吗?请各位朋友提宝贵建议(不用玻璃珠破细胞)。我要尽可能把样品中的质粒都抽提出来，然后 REAL TIME PCR定量，好计算每个酵母细胞中的质粒拷贝数目。因为样品少，不能做SOUTHERN BOLT计算拷贝。谢谢
1. 阳性克隆的筛选 （1）随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。 （2）如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。2. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆 （1）将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养
后可以得到多个整合拷贝，在数量上占有优势。 附加型载体则是以其自身来源的2μ质粒作为出发质粒衍生出的多种表达载体。这类载体在酵母细胞内本身拥有独立自主复制的能力，常以30或更多拷贝数存在。AtaGenix的pYES2-NTA就是这种类型的表达载体，可使外源基因得到有效表达。 通常酿酒酵母宿主菌是各式各样的营养缺陷型（如his3-，leu-，trp-，ura3-等）酵母菌，能适用于不同载体的转化筛选。但是在表达外源蛋白时，常会出现载体丢失、蛋白产物不均一、过度糖基化、不易积累以及副
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