全血microRNA提取试剂盒

特别提示：包括全血microRNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：全血microRNA提取试剂盒
英文名称：microRNA Extraction Kit From Blood

产品货号：全血microRNA提取试剂盒
产品规格：25T|100T

我公司的全血microRNA(miRNA)提取试剂盒提取小RNA(＜200nt)具有操作步骤简单、重复性最好、产率较高的特点。核酸提取的成功与否、提取质量的好坏对后续实验起着至关重要的作用。使用TRIzol试剂提取总RNA，对总RNA中包含的部分小RNA进行研究，该方法的缺点是总RNA中microRNA的比例较小，同时由于mRNA的干扰，会导致后续反转录和RealTime PCR实验效率很低，很难获得理想的实验结果，且结果不可靠。Biorab在探索miRNA分子功能的过程中开发的全血miRNA提取试剂盒，通过一步上柱即可获得纯度高达98%的不含大RNA的miRNA，而且可在45分钟内完成小RNA的提取。该miRNA提取试剂盒广泛适用于冻存和新鲜的抗凝全血样本（不适用于血清和血浆），每150μl全血可获得~1μg的microRNA。

产品组成：

组分	MT0002A	MT0002B
miRNA Reagent A	7.5ml	30ml
miRNA Reagent B	10ml	40ml
miRNA 吸附柱	25套	100套
Rnase-Free TE Buffer	5ml	5ml

储存：室温可保存2年。
自备试剂：异丙*、乙醇、75%异丙*
注意：miRNA Reagent A溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就医。

操作方法：
1．向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。将150μl 抗凝全血加入到上述300μl miRNA Reagent A中，立即手腕用力震荡混合均匀。室温静置 5分钟 以充分裂解细胞。
2．向上述裂解完毕的裂解液中加入250μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。
3．向上述溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5分钟。
4．13000rpm离心10分钟，转移700μl上清液到新的1.5mlEP管中。
5．向上述溶液中加入300μl 异丙*，手腕用力上下颠倒数次。
6．分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
7．向吸附柱中加入700μl 75%异丙*洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
8．向吸附柱中加入500μl无水乙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。
9．吸附柱 13000rpm 空离心2分钟，去掉残留的乙醇。
10．将吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室温放置 2分钟，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2分钟，13000rpm离心2分钟，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取3～5μl该产物，即可使用我司TaqMan miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：MT0006）。


图例：应用全血miRNA提取试剂盒（MT0002）提取全血的microRNA。
 泳道1-3：-80℃冻存一年的全血；
 泳道4-6：新鲜抗凝全血。


常见问题：
1．本方法提取的小 RNA，95％以上为小 RNA（<200nt），有时会残留一些>200nt的RNA，通常残留的>200nt RNA不影响后续试验操作。
2．本试剂盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的RNA，因此更适合做后续反转录试验，从而进行定量试验。
3．使用本试剂盒提取的microRNA 浓度通常在50ng/μl 左右，取5～10μl即可用于电泳检测。取3~5μl即可用于我司TaqMan miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应（货号：MT0006），通常使用我司优化的miRNA-TaqMan RealTime PCR技术（货号：MTTxxxxx）。

除了全血microRNA提取试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：非冻型血液RNA保存液
货号：BTN111202
规格：100mL
由于血液富含RNase，因此血液RNA非常容易降解，是临床分子生物学研究中的一个棘手的问题。为解决此问题，本公司在非冻型组织RNA保存液的基础上，开发了本产品。

产品特点：
1. 能快速渗透到新鲜血液细胞内，抑制RNA分子的降解。保存的血液RNA常温可放置3天，4℃可放置5天，-20℃可放置3个月。
2. 操作简单，直接将本产品和新鲜血液细胞沉淀按比例混合即可。
3.适用于人新鲜血和哺乳动物新鲜血液，不适用于陈旧血液和冻凝血液，也不适用于禽类血液和其他动物血液。
4. 重复性好，效果跟进口同类产品相当。
5. 保存的样品可直接用本公司血液RNA提取试剂盒提取RNA。

储存条件：室温运输及保存，有效期两年。

使用方法：
注意：RNase污染无处不在，最好用本公司的高效无毒固相RNase清除剂处理RNA工作区域，千万不要使用烷基化试剂DEPC(相当于芥子*(代"气"))。

一:以白细胞为材料的保存方法(此法效果好于全血保存法)
1.室温1500-2000 g离心新鲜抗凝血液10-15分钟，最上层为血浆，最下层为红细胞，中间层为膜状的、含白细胞的Buffy Coat(含白细胞多的血液此层可能很厚)。
2. 吸出血浆后，小心将中间的白细胞层吸出(允许污染部分红细胞)到新的离心管中，加入5-10倍体积的本产品，混匀后放常温(不超过30℃)保存不超过3天或者放-20℃保存3月(放-20℃前需要现在4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入-20℃，冰晶会刺破白细胞，释放出其中的RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。

二：以EDTA抗凝全血为材料的保存方法
3. 将血液取到EDTA抗凝管中后，迅速将0.5mL血液与1.5mL本产品混合，充分颠倒混匀，然后放常温(不超过30℃)保存不超过3天或者放-20℃保存3月(放-20℃前需要现在4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入-20℃，冰晶会刺破白细胞，释放出其中的RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。

三：血液RNA的提取(本产品不含RNA提取试剂。此处以本公司的跟Trizol相当的动物RNA提取试剂盒操作步骤为参考。用户也可以使用其他RNA纯化试剂)
4. 提取RNA时，如果保存的白细胞在-20℃，则需要先室温化冻，如果保存在常温或4℃，则直接使用。
5. 取1.8mL混合液到新的2mL离心管中，5000g室温离心1分钟。
6.小心吸弃上清液(本产品)，细胞将形成沉淀(如果样品时全血，沉淀中将含有大量血液蛋白)。注意：上清一般会很浑浊，一定要尽可能弃尽。有时沉淀上面有白色晶体出现，属于正常现象。
7.在细胞沉淀中加入动物RNA提取试剂盒 1mL溶液A，剧烈震荡30秒(不能感觉到震荡即可，一定要看见管底液体旋转起来，否则只是液体表面的震动，下同)。震荡后颠倒几次看溶液是否均匀，如果有颗粒状物体说明还需要震荡裂解。
8.室温放置5分钟以使细胞充分裂解。
9. 将0.2mL自备的氯*加入到离心管中，剧烈震荡30秒。
10. 12000～15000g4℃离心3分钟。一般上清为无色的水相(含RNA，约0.5-0.9mL)；中间层为白色，含有DNA、蛋白质和其他细胞破碎物，不要触及；下层为有机相，一般呈深红色。注意：有时水相比重大于有机相，出现反相现象，此时应该取下面的水相。
11.小心将水相转移到另一自备的1.5mL塑料离心管中。如果水相超过0.75mL，则需要分成2管，否则在下步没法加入等体积的异丙*。
12. 加入等体积的异丙*到水相中，充分颠倒混匀。
13. 12000～15000g4℃离心10分钟沉淀RNA。
14. 吸弃上清。注意：如果离心后出现两个相，则需要吸弃上面的一相，然后在下相(含RNA)中加入一倍体积的超纯水和一倍体积的异丙*，混匀后12000～15000g4℃离心10分钟沉淀RNA，吸弃上清。
15. 将75% RNase-free乙醇加入到RNA沉淀中，震荡几秒后12000～15000g4℃离心1分钟。
16. 弃上清
17. 12000～15000g4℃离心半分钟，用移液枪去除残留的液体。
18. 将20-50μL DEPC处理的水加入到沉淀中并吹打溶解，立即用于下述完整性、产率和纯度的检测，也可直接用于后续RT-PCR等试验或存放于-80℃待用。

四: RNA的检测(列出步骤仅供参考，本产品不提供相关产品)
19. RNA完整性的电泳检测：强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶中单链RNA分子会自生折叠成各种形状，尤其不能使用DNA上样液，因为没有经过去RNase处理。
20. RNA产量产率测定：将5-10μl RNA用TE缓冲液(pH8.2)稀释10倍后检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血RNA产率一般为2-5μg/mL。
21. RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。