线粒体细胞质分离试剂盒

线粒体细胞质分离试剂盒
ReadiPrep 线粒体/细胞质分离试剂盒提供了从哺乳动物细胞或组织中分离线粒体和细胞质组分的便捷方法。 分离的线粒体是完整的，可以用线粒体标记（例如MitoLite Green）进行阳性染色。 分离的线粒体保留其生物学活性，并与许多下游应用兼容，包括研究线粒体呼吸，线粒体膜电位，凋亡，mtDAN和mtRNA以及线粒体蛋白谱分析等。该试剂盒提供了两种分离线粒体的选择。 一种选择是利用基于试剂的方法，该方法允许同时进行多个样品制备。 第二种选择是利用Dounce均质化

样品实验方案

简要概述

1. 用PBS洗涤细胞
2. 加入2 mL隔离缓冲液
3. 在冰上孵育10分钟
4. 使用均质器均质化细胞或添加试剂A。
5. 7000g离心10分钟
6. 去除上清液（细胞质部分）
7. 将沉淀重悬于隔离缓冲液中
8. 7000g离心10分钟
9. 将沉淀重悬于测定缓冲液（线粒体级分）中

实验步骤

1.用冷PBS洗涤细胞一次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入2 mL分离缓冲液（组分A），并在冰上孵育10分钟。

3.可以通过两种方式提取细胞质。

①：将40 µL试剂A（组分B）加入混合物中，涡旋并在冰上孵育10分钟。

②：使用Dounce组织研磨机匀浆4-5次，使细胞匀浆。

4.在4°C下以600 g离心10分钟，收集上清液，在4°C下以7,000 g离心10分钟。 上清是细胞质部分。

5.将沉淀重悬于1 mL分离缓冲液（组分A）中，并在4°C下以7,000 g离心10分钟。

6.丢弃上清液，并根据下游应用将沉淀重悬在适当的测定缓冲液中。

7.蛋白质浓度可以通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（Cat＃11100）进行定量。

图示

图1.使用ReadiPrep 线粒体/细胞质分离试剂盒收集HeLa细胞的线粒体组分。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有MitoLite Green（＃22675）的情况下孵育100 µg线粒体片段，并用NovoCyte 3000流式细胞仪进行测定。

参考文献

Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76

and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70