磷酸化白细胞F肌动蛋白结合蛋白抗体

磷酸化白细胞F肌动蛋白结合蛋白抗体技术参数
研究领域：细胞生物  信号转导  细胞凋亡  细胞类型标志物  肿瘤细胞生物标志物  新陈代谢  线粒体  
抗体来源：Rabbit
浓    度：1mg/ml
免 疫 原：KLH conjugated synthetic peptide derived from human Bcl-2:101-160/236 
亚    型：IgG
纯化方法：affinity purified by Protein A
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储 存 液：0.01M TBS(pH7.4) with 1% BSA, 0.03% Proclin300 and 50% Glycerol.
保存条件：Store at -20 °C for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at -20°C. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent of antibody the antibody is stable for at least two weeks at 2-4 °C.

磷酸化白细胞F肌动蛋白结合蛋白抗体操作问题指南

WB实验关于没有信号或信号微弱
问：旧的检测试剂或底物试剂盒
答：使用新的检测缓冲液。
问：一抗孵育时间不足
答：延长一抗的孵育时间或在4℃下过夜孵育。
问：薄膜过度洗涤
答：不得过度洗涤薄膜 - 过度洗涤可能洗去一抗。尝试洗涤 3 次，每次 5 分钟。
问：封闭液
答：脱脂牛奶可能掩蔽抗原。尝试减少封闭液和抗体溶液中的牛奶量，或用不同的封闭液替代，比如BSA。
问：转膜不完全
答：优化转膜条件（如时间、电流）。实施下一个步骤之前，重新确认转膜程序是否完全。
问：抗体过期
答：使用新鲜的抗体溶液以获得最佳性能。
问：使用不相匹配的二抗
答：使用在一抗同种寄主的二抗孵育。采用阳性对照，用以确保二抗正常起效。
问：一抗浓度不足
答：采用更高的抗体浓度。我们的方案中提供了关于抗体稀释的指南。采用阳性对照，用以确保一抗正常起效。
问：存在难度较高的目标蛋白质
答：尝试使用最为灵敏的检测试剂。
问：上样量不足
答：提高在凝胶上养孔加入的样本量 每孔使用 25-50μg 细胞/组织溶解物蛋白质。每孔至少加载 25μg 细胞溶解物蛋白质。
IHC实验关于不染色    
问：二抗不匹配
答：选择针对一抗同种寄主 IgG 的二抗。
问：与抗体一同孵育的时间不足
答：延长抗体孵育时间。
问：用于蛋白质检测的抗体数量不足
答：尝试使用更高浓度的一抗并延长孵育时间
问：样本中的目标蛋白质数量不足
答：检查与目标蛋白质组织专属性相关的信息。使用最为灵敏的检测试剂。
问：抗原被标记
答：使用适宜的抗原修复方法，去除福尔马林固定破坏已形成的蛋白质交联结构。
问：去石蜡化程度不足
答：更换二甲苯溶液并延长样本脱蜡时间。
 
背景值高或非特异性染色   
问：组织中存在自发荧光或自然荧光
答：与抗体一同孵育前，用荧光显微镜检查组织切片。如检测到荧光信号，则选择其他检测系统，不得使用荧光法。
问：内生生物素信号
答：如使用生物素-抗生物素蛋白系统，用非结合抗生物素蛋白进行组织样本预处理。
问：内生碱性磷酸酶活性
答：如使用 AP 作为标记，用左旋咪唑溶液进行组织样本预处理。
问：内生过氧化物酶活性
答：与一抗一同孵育前，组织样品用 3% H2O2 进行预处理。
问：二抗的非特异性结合
答：为二抗单独设置一个对照切片。
问：抗体浓度可能过高
答：降低抗体浓度。

ELISA实验
问：与底物一同过度孵育
答：尝试缩短孵育时间，以防止信号过度显色。
问：在光照条件下实施底物孵育。
答：添加底物后，立即将平板置于暗处。
问：重复使用平板
答：使用新的平板。
问：底物缓冲液陈旧
答：使用新鲜的底物试剂。
问：抗体浓度可能过高
答：降低抗体浓度。
问：封闭时间不足
答：延长封闭时间或使用更多封闭液或不同的封闭液。
问：阴性对照污染
答：可能被其它样本或试剂污染。防止上样孔间发生溢流。仔细移液。
问：平板洗涤量不足
答：确保上样孔被洗涤缓冲液充满，并确保完全除去每个上样孔中的残留溶液。增加洗涤次数。
 
吸收值低   
问：波长不正确
答：确保设置正确的波长用于检测信号。
问：底物溶液孵育时间不足
答：优化孵育时间，直至平板显色程度足以进行 ELISA 读数。
问：抗体用量不足
答：尝试使用浓度更高的抗体。孵育抗体时采用推荐的孵育时间。
问：样本中没有目标蛋白质表达
答：搜索与目标蛋白质表达特征相关的信息。增加样本用量或使用更为灵敏的检测试剂。
 
复制不良或重现性差  
问：移液错误
答：仔细加入样本，避免上样孔中出现气泡。
问：涂抹不均
答：检查涂抹程序，使用适宜的 ELISA 平板。
 
IF实验

问：样本固定过程使抗原决定簇受到破坏
答：尝试不同的样本固定方法，如福尔马林或戊二醛。甲醇可能导致细胞膜破裂。
问：细胞透性差
答：使用 0.1 Triton X-100 处理 15 分钟，以提高细胞通透性，或延长孵育时间。
问：洗涤不足
答：使用 PBS 轻柔地洗涤切片。不要长时间浸泡在洗涤缓冲液中，或用蒸馏水冲洗。
问：二抗曝光
答：将二抗储存在暗处。
问：二抗用量不足
答：确保二抗对一抗的特异性。
问：封闭过强
答：缩短封闭时间。
问：发生蛋白质表达的细胞过少
答：尝试使用样本中的更多细胞或使用稳定转染的细胞系。
问：蛋白质没有在细胞中得到表达
答：制备细胞提取液，用蛋白质印迹法检查是否存在目标蛋白质。
问：抗体孵育时间过短
答：延长孵育时间。
问：抗体浓度稀释过度
答：建议采用更高的浓度。
 
背景值高或非特异性染色    
问：样本洗涤不充分
答：每个步骤结束时，用 PBS 彻底洗涤 5 分钟并重复5 次。
问：孵育温度过高
答：样本在4℃下孵育过夜，或室温下孵育 4 小时。
问：二抗无特异性
答：检查二抗的特异结合情况。设置不含一抗的二抗对照。
问：孵育时间过长
答：缩短与主要/二抗一同孵育的时间。
问：一抗浓度过高
答：稀释抗体浓度
问：使用错误的封闭液
答：尝试使用不同的封闭液，如 5% 山羊血清，PBS 中孵育1 小时。
问：检测样本固定过度
答：缩短固定时间。
以上磷酸化白细胞F肌动蛋白结合蛋白抗体操作问题指南是我们在解决同产品相关问题时建议试验的步骤。您在开始操作实验碰到问题无法解决，利用其它解决方法依旧没办法解决您的问题时，可以从这里着手。在尝试这些步骤时，大多用户都能将他们的问题解决。