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Pfu DNA Polymerase
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北京百奥莱博科技有限公司
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北京百奥莱博科技有限公司专业生产供应北京Pfu DNA聚合酶报价,产品信息:
类别:核酸扩增(PCR)
英文名:Pfu DNA Polymerase
产品名 | 产品编号 | 包装规格 |
Pfu DNA聚合酶 | JN0016 | 250U|250U×5 |
规格:250U|250U×5
编号:JN0016
英文名:Pfu DNA Polymerase
产地:国产|进口
本酶为Pyrococcus furiosus中分离的pfu DNA pol基因在大肠杆菌中进行表达后经多步纯化分离而得。Pfu DNA聚合酶具有3´→5´外 切酶(校正)活性,当聚合反应发生碱基错配时,聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。Pfu DNA聚合酶为使用范围最广的高保真DNA聚合酶,其错误率仅为1.3x10-6,推荐Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反应。
产品组成:
组份 | JN0016-250U |
Pfu DNA 聚合酶(5U/μl) | 50μl |
dNTP混合液(各10mM) | 200μl |
10×Pfu DNA Buffer with Mg2+ | 2ml |
产品用途:用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入 突变、全基因合成,DNA片段的补平等(参见实验方案)。
使用建议:
Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3´端"A"突出,其PCR产 物的克隆有几种方案。
1、PCR前引物进行5´端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆 于平滑末端的载体中(参见实验方案)。
2、将产物3´末端加A后再与T载体连接(参见实验方案)。
3、引物中引入15bp与载体同源序列,利用BalbRec PCR产物一步定向无缝克隆试剂盒(Cat# JN0001)直接连接到目的载体。
由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3´端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为20-30碱基。另外为了减少由3´→5´外切酶活性引起的引物降解,尽量在冰上配制反应体系,并最后加入Pfu酶。
应用实例:
图例一)50μl扩增体系中,以5ngλDNA为模板,对500bp~6.0kb片段的扩增结果。
泳道1:0.5kb;泳道2:1.0kb; 泳道3:2.0kb;泳道4:3.0kb; 泳道5:4.0kb;泳道6:6.0kb 泳道M:1kb DNA Marker;
图例二) 50μl扩增体系中,分别以50ng~0.05ng人基因组DNA为模板,可对特定基因片段(380bp)进行很好的扩增。
泳道1:50ng;泳道2:5ng;泳道3:0.5ng;泳道4:0.05ng;泳道M:DNA 2000 Ladder
常用反应体系(50μl)
10×Pfu Buffer | 5μl |
上游引物 | 0.2-1.0μM(终浓度) |
下游引物 | 0.2-1.0μM(终浓度) |
dNTP(各10mM) | 1.0μl |
模板 | 1-50ng(质粒) |
10ng-1μg(基因组) | |
Pfu | 0.25μl(1.25U) |
ddH2O | 至50μl |
*Mg2+终浓度为1.5mM |
常用PCR循环:
当扩增片段<3K:
温度 | 时间 | 循环数 |
94℃ | 1分钟30秒 | |
94℃ | 30秒 | 30次循环 |
57℃ | 30秒 | |
72℃ | 根据产物长度调整,60秒/kb | |
72℃ | 5分钟 | |
4℃ | 保温 |
当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp):
温度 | 时间 | 循环数 |
94℃ | 20秒 | |
94℃ | 5秒 | 30次循环 |
68℃ | 根据产物长度调整,60秒/kb | |
72℃ | 5分钟 | |
4℃ | 保温 |
质量保证:经多次柱纯化,SDS-PAGE检测纯度大于95%;PCR 方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。
活性定义:在74℃条件下,30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。
北京Pfu DNA聚合酶报价专业优质供应商:北京百奥莱博科技有限公司
关键词:Pfu DNA Polymerase,Pfu DNA聚合酶,JN0016
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