- ¥307
- 联迈生物
- LM7010S
- 中国/上海
- 2025年07月15日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
Seamless Cloning Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海联迈生物工程有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
20次
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| LM7010S | Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒) | 20次 | 307.00元 |
Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确
地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。
和传统的基因克隆方法相比，本试剂盒的无缝克隆方法有多方面的突出优点：(1) 最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此是真正的"无缝克隆"；(2) 可通过一个反应将一个或多个片段快速、定向地插入到载体的任何位置；(3) 待插入的PCR扩增产物无须酶切；(4) 插入片段的大小范围宽，从20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通过PCR扩增获得线性化载体，因此限制性内切酶消化并不是克隆所必须的；(6) 酶催化的重组连接反应非常快速和高效，对于一个片段的插入仅需50℃处理15分钟；对于三个片段的插入仅需50℃处理30分钟，而对于5个片段的插入也仅需50℃处理约60分钟；(7) 只有插入片段和线性化载体的末端才能发生同源重组，可以有效避免非特异性的同源重组；(8) 阳性克隆比例高，单个DNA片段克隆的阳性率几乎为100%，三个片段的克隆阳性率约为70-80%。
本无缝克隆试剂盒操作非常简单。本试剂盒进行基因克隆时没有酶切位点的限制，仅需在载体的预定克隆位点通过酶切进行线性化或通过PCR的方法直接制备线性化的载体，在插入片段的两个PCR引物的5' 端引入与载体克隆位点两端完全一致的
15~25bp的重叠序列。重组反应可以在50℃快速进行，3-4小时内即可完成从DNA样品的PCR扩增、纯化、重组、到转化涂板的全部操作。其中PCR反应约2-3小时，PCR产物纯化约20分钟，重组反应15分钟，转化涂板约40分钟，共计约3-4小时即可完成。
联迈生物无缝克隆试剂盒的工作原理示意图请参考图1。
图1. 联迈生物无缝克隆试剂盒的工作原理图。重叠区域(overlap region)的DNA序列完全一致，通常长度为15-25bp。不同颜
色的重叠区域代表不同的重叠序列。在插入2个或以上片段时，不同的重叠序列可以确保待插入片段有序地插入到线性化的载体(linearized vector)中。
本试剂盒用于一个1100bp片段的克隆和三个不同的1100bp片段的克隆，其重组反应产物转化DH5α感受态细胞后涂板获得的LB平板的实测效果参考图2A，菌落PCR鉴定结果参考图2B。
图2. 本试剂盒用于无缝克隆的实测效果。A. 本试剂盒反应产物转化感受态细菌DH5α后涂板获得的LB平板效果图。在20μl反应体系中，将双酶切线性化的载体pUC18 (Linearized pUC18)，与通过PCR扩增的含有重叠序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:3)；或者与3个有适当重叠序列的不同的1100bp片段混合，pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:1:1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水补至20μl，50℃反应15min(插入一个片段)或
30min(插入三个片段)。反应结束后，将反应产物放置在冰上5min，取5μl转化到100μl的DH5α感受态细菌中。对照组中只加入线性化的载体pUC18，同时也在50℃反应15min。实验结果表明，插入片段数目越多转化后得到的克隆数越少。B.菌落PCR鉴定用本试剂盒构建得到的克隆。实验结果表明，插入1个片段时的阳性率基本上为100%，插入3个片段时的阳性率约为70%左右。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| LM7010S-1 | 2X Seamless Cloning Mix | 200μl |
| LM7010S-2 | Linearized pUC18 (50ng/μl) | 10μl |
| LM7010S-3 | DNA fragment (1100bp, 60ng/μl) | 10μl |
| LM7010S-4 | Nuclease free water | 200μl |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
单个片段的PCR产物进行重组反应时，如果PCR条带单一，可以无须纯化并直接进行重组反应，但PCR产物的体积不得超过重组反应体系的20%，并且重组效率通常会低于纯化后的PCR产物。
对于多个片段的重组反应，重组效率通常会低于单个片段的重组效率，建议胶回收纯化后再进行重组反应。对于3个以上片段的重组反应或重组片段大于5kb时，强烈建议在胶回收后再进行重组反应。通常胶回收后，重组效率可提高2-10倍。
单片段和线性化载体重组时，摩尔比至少为2:1。多片段和线性化载体重组时，各个片段和线性化载体的摩尔数宜保持一致。
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