Dopamine receptor1/DRD1 mRNA原位

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名称：Dopamine receptor1/DRD1 mRNA原位杂交试剂盒哪里卖
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：hμman,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Dopamine receptor1/DRD1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Dopamine的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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BL1286 10×PBST
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硫*(代"酸")*基胍 Triphenylmethane 996-19-0
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2-羰基丁酸*盐 Chitosan 2013-26-5
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1.5M Tris (pH8.8)   100ml
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乳酸脱*酶(LDH)检测试剂盒(LD-P微板法)   100T
BL0906 FITC标记兔抗猴IgG抗体
BL1119 碘化丙啶PI溶液(1mg/ml)
ARB12017 大鼠αL岩藻糖苷酶(AFU)elisa测定使用说明书 Rat alpha-l-fucosidase,afu ELISA KIT
CYB164009 兔抗豚鼠IgG-HRP
PY02-334  糖类发酵培养基  250克  
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DP408 RNAStore样本保存液
BL0882 兔抗山羊IgG免疫血清
ARB13357 牛白介素2(IL-2)含量检测 Bovine interleukin 2,IL-2 ELISA KIT
O-*并三氮唑-N,N,N,N,-四甲脲六*磷酸酯 TLCK 94790-37-1
乙酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH5.0)   500ml
D0301 脱纤维绵羊血(无菌 pet瓶装) 100ml/200ml/500ml
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·人Resistin重组蛋白
编号：ZN1705
规格：100ng
来源：大肠杆菌
特异性：人
应用：WB 阳性对照
形态：冻干粉
纯度：>98%，RP-HPLC&SDS-PAGE
保存条件：-20℃保存 1 年以上，避免反复冻融。

·WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
编号：ZN1543
规格：100T/500T
产品规格：100次
WST-1(粉末)1 管
电子耦合试剂 1ml
产品保存：-20℃避光保存，一年有效。WST-1 粉末溶解后，4℃避光可以保存一周，-20℃避光可以保存半年(宜适当分装，尽量避免反复冻融)。
产品说明：
1．WST-1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
2．WST-1 是一种类似于 MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱*酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
3．WST-1 是 MTT的一种升级替代产品，和 MTT 或其它 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。首先，MTT 被线粒体内的一些脱*酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1 产生的formazan 比 XTT和 MTS 产生的formazan 更易溶解。再次，WST-1 比 XTT和 MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT 等相比，线性范围更宽，灵敏度更高4．本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。
5．本试剂盒检测非常便捷。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块 96 孔板内完成。
不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解 formazan。可以用于大批量样品的检测。
6．酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。
7．WST-1 对细胞无明显毒性。加入 WST-1 显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。
8．本试剂盒可以测定 100 个样品。
使用方法：
1．WST-1溶液的配制：把1ml电子耦合试剂加入到WST-1粉末中，完全溶解即成WST-1溶液。WST-1溶液4℃避光可保存一周，而不影响使用效果。短期内不使用的WST-1溶液，分装后可以-20℃避光保存半年(尽量避免反复冻融)。冻存的WST-1溶液溶解后可能会观察到一些沉淀物，这是正常现象，37℃水浴孵育2-10分钟，通常可以完全溶解。
2．收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000 孔，(边缘孔用无菌 PBS 填充)。5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定)。加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，每孔 0-10μl，设 3-5 个复孔.建议设 5 个。
3．每孔加入 10μl WST-1 溶液，继续培养 4 小时。若药物与 WST-1 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 WST-1的培养液。
4．在细胞培养箱内继续孵育时间长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在 0.5、1、2和 4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
5．把 96 孔板置于摇床上摇动一分钟，以充分混匀待检测体系。
6．在 450nm 测定吸光度。如无 450nm 滤光片，可以使用 420-480nm的滤光片。可以使用大于 600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。
注意事项：
1．由于使用 96 孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加 PBS，水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2．使用时最好带那种透明的簿膜手套。

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