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3个月
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MiaoLingBio
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1000
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淼灵生物
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1管
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文献和实验CRlSPR/Cas9是细菌和古生物菌用来抵抗外来质粒或噬菌体等遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。利用CRlSPR/Cas9技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA文库的建立将在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。 CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选流程
已经成为体外基因组编辑的最流行系统，但体内的基因编辑方法仍然受到 Cas9 导入问题的限制。腺相关病毒载体（AAV）因免疫原性低而常用于基因的体内导入。不过，由于 AAV 只能容纳~4.5 kb，化脓链球菌（spCas9）和 gRNA（总共~4.2 kb）要包装到 AAV 载体中还是很有挑战性的。研究人员随后在 Cas9 的同源物中，找到了金黄色葡萄球菌的 Cas9（SaCas9），证明其在哺乳动物细胞中表现出切割活性。并且长度适合插入 AAV 载体中，效率与 SpCas9 相似，适合体内研究
9-KRAB）要靶向 TSS 附近约 −50 到 +100 bp 的窗口； CRISPRa（dCas9-VP64 / SAM）要靶向 TSS 上游约 −400 到 −50 bp； 用敲除的逻辑去设计 CRISPRi 的 gRNA，是常见的低级错误。 --- 二、序列层面的硬禁忌，一条都不能碰 拿到候选序列后，先做这几项过滤： PAM 必须正确：SpCas9 是 3' 端 NGG；SaCas9 是 NNGRRT；SpCas9-NG 是 NG；SpRY 几乎不依赖 PAM。用错 PAM 模型会得到完全
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