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Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit
一年
北京百奥莱博科技有限公司
-20℃
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产销*(代"售")细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒价格厂家,我公司供应的分子生物学试剂品类齐全,且具有优势价格,欢迎新老客户垂询订购。
名称:细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒价格厂家
编号:SY0327
产地:国产|进口
品牌:百奥莱博
细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒用于快速便捷分离细胞/组织细胞膜和细胞浆蛋白,抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的蛋白,也包括线粒体膜、内质网膜以及高尔基体膜等上的膜蛋白。主要工作原理:通过匀浆适度破碎细胞,经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀,随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清,然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。整个过程仅需约90min即可完成,抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE,Western、酶活性测定等后续实验。
膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等,后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定,但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。
按照说明书步骤的用量(细胞2-5×107个;组织约100mg),SY0327可分别进行50个样品的抽提,具体用量可根据不同的样品体积进行调整。
试剂盒组份:
试剂A:50ml
试剂B:15ml
储存条件:-20℃,有效期一年。
注意事项
1)客户需自备PMSF,PMSF需现配现用,建议在抽提试剂加入到样品前2-3min加入,以防失效。
2)利用本试剂盒抽提到的细胞膜/细胞浆蛋白可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(Yeasen Cat#20201)测定其浓度,但不适合用Bradford法测定。
3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
室温融解并混匀试剂A和B,融解后立即置于冰上。取适量的试剂A和B备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使其最终浓度为1mM。
1 样品准备
1)细胞样品
① 细胞收集
贴壁细胞:培养细胞约2-5×107个,PBS清洗一遍,用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。
【注】:尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
悬浮细胞:培养细胞约2-5×107个,离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。
② 细胞清洗
用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,取少量细胞用于计数,剩余细胞4℃,600g离心5min沉淀细胞。弃上清,随后4℃,600g离心1min,以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞,尽最大努力吸尽残留液体。
③ 细胞预处理:把1ml试剂A(含PMSF)加入至上述细胞中,轻轻并充分悬浮细胞,冰浴放置10-15min。
2)组织样品
取约100mg组织,用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1ml试剂A(含PMSF),轻轻悬浮组织碎片,冰浴放置10-15min。【注】:如果组织样品比较少,也可以使用更少的组织量,例如30-50mg,后续试剂的用量及操作步骤不变;组织用量较少时,最后获得的膜蛋白也较少。
2 样品的破碎及破碎效果的鉴定
① 样品匀浆:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中,匀浆约30-50下。【匀浆效果与细胞类型和组织类型相关,不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同,需自行优化。】
② 通常在匀浆30次后取约2-3µl匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察,如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完整的细胞形态,说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态,说明细胞已经充分破碎,则进行下一步实验。否则,重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数,通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关,需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。
【注】:如果没有适当的玻璃匀浆器,对于培养的细胞也可以采用反复冻融法来破碎细胞。把样品在液氮和室温依次反复冻融两次,然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%,可增加冻融次数,直到细胞破碎的程度大于70%。
3 去除细胞核和未破碎的细胞
在4℃,700g离心10min,小心收集上清液至一新的离心管中。【注】:吸取上清时切勿接触沉淀!可以有约30-50µl上清液残留不予吸取,以保证吸取的上清液有较高的纯度。
4 沉淀细胞膜碎片
在4℃,14000g离心30min,以沉淀细胞膜碎片。
5 收集细胞浆蛋白
吸取上清至1新的离心管中,即为细胞浆蛋白,可-70℃保存备用。吸取上清时可以有30-50µl上清残留,以避免接触沉淀导致上清样品被污染。
6 抽提膜蛋白
4℃,14000g离心10sec,尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀,甚至吸走很少量的沉淀。加入试剂B 200µl(如有必要,也可加大到300µl),最高速剧烈Vortex 5sec重悬沉淀,冰浴5-10min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次,以充分抽提膜蛋白。随后,4℃,14000g离心5min,收集上清即为细胞膜蛋白溶液。可-70℃保存备用。对于一些有特殊用途的膜蛋白,可自行配制适当的膜蛋白抽提试剂进行膜蛋白抽提。
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·36mm透析袋(透析分子量14kDa)
编号:SY0416
英文名称:Dialysis Tube MD44 (Mw14,000)
规格:1卷(5米)
透析袋通常为半透膜制成的袋状,以此为屏障对目的蛋白进行脱盐以及进行缓冲液的置换,透析的主要原理是:透析袋内样品的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到透析袋外,直到透析袋内外两边的浓度达到平衡为止。透析袋透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析袋透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度,通常是4℃透析。
本透析袋参数:扁平宽度为44mm,直径36mm,截留分子量14kDa。
储存条件:4℃,有效期2年。
注意事项
1)每次使用后将余下的膜放回袋子并密封好,以防干裂。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1)把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段,具体长度需根据待透析的样品而定。
2)在大体积(eg.500mL)的2%(W/V)的碳酸**和1mmol/L EDTA (pH=8.0)中将透析袋煮沸10min。
3)用蒸馏水彻底清洗透析袋。
4)放在大体积(eg.500mL)的1 mmol/L EDTA (pH=8.0)中将之煮沸10min。
5)冷却后,存放于4℃,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。【注】:从此时起取用透析袋必须戴手套。
6)在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净。
7)使用时,一端由透析夹夹紧,另一端灌满水,用手指稍加压,检查不漏,方可装入待透析液。
【注】:
① 通常要留1/3~1/2的空间,以防透析过程中,透析的小分子量较大或样品含盐量较高时,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。
② 为了加快透析速度,除多次更换透析液外,还可使用转子边搅拌边透析。透析的容器要大,如大烧杯等。
·高分辨率琼脂糖(PCR级)
编号:SY0256
英文名称:High Sieving Agarose
规格:5g
琼脂糖(Agarose)是纯化的线性半乳聚糖亲水胶体,提取自琼脂或者含琼脂的海藻,结构上是一种线性聚合物,由β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基构成。作为一种凝胶试剂,常用于通过凝胶电泳或者印迹法(如Northern或Southern)来进行日常核酸分析,也适用于蛋白应用,如辐射状免疫扩散(RID)实验。
本品为PCR级高分辨率琼脂糖,对PCR产物、小片段DNA具有较高的分辨率,适宜分离20bp-800bp的DNA片段,其分离效果可与聚丙*(代"烯")酰胺相媲美。此外,还具有如下特点:
1)易溶解,胶液更清澈,可以配制高达5%的凝胶;
2)很低的背景;
3)品质稳定等。
琼脂糖的基本参数,包括:
1) 硫*(代"酸")盐含量(sulfate content)——纯度指标,因为硫*(代"酸")根是存在琼脂糖内的主要离子基团;
2) 凝胶强度(gel strength)——施加于凝胶使之断裂的外力;
3) 胶凝点(Gel point)——水溶性琼脂糖溶液冷却后形成凝胶时的温度。液体向凝胶转化的过程中,琼脂糖溶液具有滞后性,因此,胶凝点不等同于胶熔点。
4) 电渗(EEO)——液体穿透凝胶的一种电动运动。琼脂糖凝胶内的阴离子基团吸附在基质上不会发生迁移,但是解离的阳离子就会朝负极迁移,从而产生电渗。由于生物聚合物的电泳迁移通常是朝负极运动,则EEO产生的内部对流会干扰分离效率。
产品性质
CAS: | 39346-81-1 |
外观(Appearance) | 白色粉末 |
凝胶强度(Gel Strength) | ≥750g/cm2(1.5% gel) |
凝胶温度(Gel Point) | ≤33℃(1.5% gel) |
融胶温度(Melting Point) | ≤70℃(1.5% gel) |
电渗值(EEO, -mr) | ≤0.10 |
外观(Appearance) | 无色清澈胶液 |
硫*(代"酸")盐(Sulfate, %) | ≤0.10% |
水分: | ≤10% |
灰分(Ash Content) | ≤0.5% |
DNA酶(DNase) | Not detected |
RNA酶(RNase) | Not detected |
蛋白酶(Protease) | Not detected |
核酸内切酶(Endonuclease) | Not detected |
线性DNA片段大小(bp) | 20-250 | 50-500 | 100-1200 | 500-2000 |
琼脂糖浓度(%) | 5.0 | 4.0 | 3.0 | 2.0 |
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