胶体金标记兔抗豚鼠IgG

胶体金标记物的制备

胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果＝低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相

免疫金银染色双PAG法

免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原——抗体的结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，结果结合更多的胶体金颗粒，再通过银增强，使原始信号得到几何级放大，其染色原理见图。双PAG免疫金银染色原理（一）染色流程：（1）石蜡切片常规脱蜡至水，0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×3min

胶体金标记蛋白质的纯化

标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。（一）超迷离心法根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心